Taq 高产 PCR 预混液的浓度为 2×，使用方便快捷，能减少 PCR 操作过程中的污染，使用时只需取适量 2×Taq 高产 PCR 预混液，加入模板和引物，并加入 ddH2O 补足体积，使反应体系浓度为 1×，即可进行 PCR 反应。PCR 产物 3′端带有突出 A 碱基，纯化后可直接用于 T/A 克隆。
该 Mix 中含有 Taq DNA 聚合酶和一种含有 3′→5′外切活性的蛋白，能够高效扩增<7 kb 的 DNA 片段，扩增产量高，配合优化后的反应缓冲液，可实现对不同 GC 含量（30%~70%）的高效扩增。此外，相较于常规 Taq 聚合酶，2×Taq 高产 PCR 预混液延伸速度提高了 2~4 倍，可有效缩短反应时间。
本 PCR Mix 中包含两种染料，PCR 产物无需添加 Loading Buffer，可直接点样电泳，且电泳过程中会出现蓝色和红色两个指示条带。该染料不影响 PCR 扩增效率，但对于需要对 PCR 产物进行吸光度、荧光等光学分析的实验，建议在分析前对 PCR 产物进行纯化。
产品信息
| 产品名称 | 货号 | 规格 |
|---|---|---|
| 2× Taq 高产 PCR 预混液 | HSM020091-01 | 5×1 mL |
| HSM020091-02 | 100×1 mL |
质量控制
• 核酸内切酶残留检测：将 25 μL 2×Taq 高产 PCR 预混液与 200 ng 超螺旋质粒 DNA 配制成 50 μL 反应体系，在 37℃下，共同温育 4 h 后，使用琼脂糖凝胶电泳检测，少于 10% 的质粒 DNA 转变成缺刻或线性状态。
• 非特异性核酸酶活性检测：将 2×Taq 高产 PCR 预混液与 15 ng 双链 DNA 片段配制成 50 μL 反应体系，在 37℃下温育 16 h，使用琼脂糖凝胶电泳检测双链 DNA 底物无变化。
反应体系和条件
反应液按下表配置（冰上操作）：
| 组分 | 体积 |
|---|---|
| 2× Taq 高产 PCR 预混液a | 25 μL |
| 正向引物（10 μM）b | 1~2 μL（0.2~0.4 μM） |
| 反向引物（10 μM）b | 1~2 μL（0.2~0.4 μM） |
| 模板 DNAc | x μL |
| ddH2O | To 50 μL |
a. 需融解完全后使用，防止离子浓度不均匀；
b. 引物推荐终浓度为 0.2~0.4 μM，效果不佳时可以在 0.1~1 μM 浓度范围内进行调整；
c. 不同模板最佳反应浓度有所不同，以 50 μL 体系为例：模板为基因组 DNA 时，一般推荐的使用量为 10~200 ng；当模板为质粒或病毒 DNA 时，一般推荐的使用量为 10 pg~5 ng。模板量过多时容易造成非特异性扩增。
扩增程序
三步法 PCR 反应程序
| 步骤 | 温度 | 时间 | 循环 |
|---|---|---|---|
| 预变性a | 95℃ | 3~5 min | 1 |
| 变性 | 95℃ | 30 s | 30~35 Cycles |
| 退火b | 55~65℃ | 30 s | |
| 延伸c | 72℃ | 15~30 s/kb | |
| 终延伸 | 72℃ | 5 min | 1 |
二步法 PCR 反应程序
| 步骤 | 温度 | 时间 | 循环 |
|---|---|---|---|
| 预变性a | 95℃ | 3~5 min | 1 |
| 变性 | 95℃ | 30 s | 30~35 Cycles |
| 退火和延伸b | 60~65℃ | 30 s/kb | |
| 终延伸 | 72℃ | 5 min | 1 |
a. 菌落 PCR 时预变性 10 min，可充分破壁细胞，大肠杆菌或酵母菌均可高效扩增。
b. 退火温度请根据引物 Tm 值设置。如果需要，推荐通过建立温度梯度寻找引物与模板结合的最适温度。此外，退火温度直接决定扩增特异性，如发现扩增特异性差，可适当提高退火温度。
c. 目的片段长度＜3 kb，延伸时间可缩短至 15 s/kb；目的片段长度＞3 kb，延伸时间建议 30 s/kb。若要达到最佳扩增效果或较高产量，推荐统一使用 30 s/kb 速度延伸。
注意事项
• 引物设计：
1. 引物 3′端最后 1 个碱基最好为 G 或者 C。
2. 引物 3′端最后 8 个碱基应避免出现连续错配，同时也避免出现发夹结构。
3. 正向引物和反向引物的 Tm 值相差不超过 1℃为佳，Tm 值调整至 55~65℃为佳（引物 Tm 值推荐使用 Primer Premier 5 进行计算）。
4. 引物额外附加序列，即与模板非配对序列，不应参与引物 Tm 值计算；引物的 GC 含量控制在 40%~60%之间。
5. 引物 A、G、C、T 整体分布要尽量均匀，避免使用 GC 或者 AT 含量高的区域。
6. 引物内部或者两条引物之间避免有 5 个碱基以上的互补序列，两条引物的 3′端避免有 3 个碱基以上的互补序列。
7. 引物设计完毕请使用 NCBI BLAST 功能检索引物特异性，以避免产生非特异性扩增。
• 产物电泳与染色：
建议使用泡染法进行电泳后染色，胶染法会导致红色指示条带发生弥散，不利于条带指示，对蓝色指示条带无影响。蓝色条带在 1% TAE 缓冲液中迁移速率约等于 1500 bp，红色条带在 1% TAE 缓冲液中迁移速率约等于 100 bp。
常见问题
无产物或产物量少
| 可能原因 | 解决方法 |
|---|---|
| 引物 | 优化引物设计 |
| 退火温度 | 设置退火温度梯度，找到合适的退火温度 |
| 引物浓度 | 适当提高引物浓度 |
| 延伸时间 | 适当增加延伸时间至 30 s/kb |
| 循环数 | 增加循环数至 35~40 个循环 |
| 模板纯度 | 使用高纯度模板 |
| 模板使用量 | 粗提样品可能需要减少使用量；其他样品使用量参照反应体系推荐量并适量增加 |
有杂带或弥散条带
| 可能原因 | 解决方法 |
|---|---|
| 引物 | 优化引物设计 |
| 退火温度 | 尝试提高退火温度，可间隔 2℃ 设置温度至 65℃ |
| 引物浓度 | 降低引物浓度至终浓度为 0.2 μM |
| 延伸时间 | 有大于目标条带的杂带时可减少延伸时间 |
| 循环数 | 减少循环数至 25~30 个循环 |
| 模板纯度 | 使用高纯度模板 |
| 模板使用量 | 参照反应体系推荐量调整 |
