本试剂盒采用改良的碱裂解法裂解大肠杆菌细胞，利用硅胶膜离心柱特异地吸附 DNA，适用于从≤500 mL LB 培养基培养的大肠杆菌细胞中高效地提取质粒 DNA。溶液包含指示剂，通过颜色的变化，指示裂解、中和是否完全，从而保证质粒提取的质量，实现操作的可视化。全新内毒素去除方案可使内毒素水平最低可至 0.001 EU/μg。
本试剂盒提取的质粒 DNA 适用于作为 mRNA质粒 DNA 模板，用于后续的线性化酶切等步骤，也可用于质粒 DNA 转化、连接、测序和转染等实验。
产品信息
| 产品名称 | 货号 | 规格 |
| 质粒去内毒素大提试剂盒 | HBP005015 | 10T |
产品组分
| 组分 | 体积 |
| BufferP1 | 120mL |
| BufferP2 | 120mL |
| BufferP3 | 120mL |
| BufferAB | 55mL |
| BufferER | 36mL |
| BufferTB1 | 110mL |
| BufferWB | 25mL |
| BufferEB | 25mL |
| RNaseA(10mg/mL) | 1.2mL |
| SpinColumn | 10个 |
| Filter | 10个 |
需自备实验过程中所需的无水乙醇、异丙醇、50 mL 离心管。
使用说明(以 100~200 mL 菌液为例)
• 使用前，将 RNase A 全部加入 Buffer P1中，之后 2-8℃保存；
• 使用前，在 BufferWB 中加入 100 mL 无水乙醇后使用。
1. 取100 mL-200 mL过夜培养14-16小时的菌液(OD600~3.0)，8,000×g 离心 4 分钟，弃上清。
2. 柱激活：向 Spin Column 膜中央加入 5mL BufferAB，8,000×g 离心 1 分钟，弃流出液后静置备用（激活后的离心柱须于1h 内使用）。
3. 加入 10mL Buffer P1(无色，使用前请确认已加入 RNase A)，充分振荡，使细菌细胞彻底混匀悬浮，无未分散的菌块。
4. 加入 10mL BufferP2（蓝色），温和地上下翻转混合 5-8 次(剧烈震荡将导致质粒DNA出现基因组DNA污染),使菌体充分裂解，形成蓝色透亮的溶液，颜色由半透亮变为透亮蓝色，指示完全裂解(不宜超过 5分钟)。
5. 向步骤4裂解产物中加入10mL BufferP3，轻柔混合 6-8 次(颜色由蓝色转变为无色，指示中和完全)，直至形成紧实的凝集块，冰浴 2 分钟。
6. 10,000×g 离心 15 分钟(菌体较多可适当延长离心时间)，将上清倒入 Filter 并推滤至全新的 50 mL 离心管中(上清体积较大需要多次推滤时，请缓慢拔起推杆以免滤片松动影响推滤效果)。
7. 向上清液中加入 3 mL Buffer ER（橙色）颠倒混匀 5 次至形成橙色悬液。
8. 向步骤 7 产物其中加入 0.3 倍滤液体积的异丙醇，颠倒混匀。将液体分多次转入离心柱，每次 8,000×g 离心 1 分钟，弃流出液，至全部液体通过离心柱(单次过柱体积不应超过 17 mL，避免液体洒漏)。
9. 加入 10mL 溶液 TB1，8,000×g 离心 1 分钟，弃流出液。
10.加入 10mL BufferWB，8,000×g 离心 1分钟，弃流出液。
11.8,000×g 离心 3 分钟，去除残留的 BufferWB。将离心柱置于新的 50 mL CollectionTube 中，离心柱开盖室温放置 5 分钟，使乙醇挥发干净。
12.在离心柱的中央滴加 1-2mLBufferEB 或ddH2O（7.0<pH<8.0）室温静置 5 分钟(Buffer EB 或 ddH2O 在 60-70℃预热后使用效果更好)。
13.8,000×g 离心 2 分钟，洗脱 DNA(为增加质粒 DNA 回收率，可将洗脱液重新加到离心柱中央重复本步骤)。
14.洗脱出的 DNA 于-20℃保存。
可选步骤（如需更高浓度的质粒DNA，可选择以下步骤进行浓缩）：
15.质粒 DNA 中加入 0.1 倍体积的 BufferP3和 0.7 体积的异丙醇混匀，室温静置 5 分钟后，12,000×g 离心 10 分钟，弃上清。
16.加 1mL 70%乙醇，12,000×g 离心 10 分钟，去上清。
17.步骤 16 重复 1 次。
18.干燥沉淀 5-10 分钟，加入适当体积的BufferEB 或 ddH2O 溶解沉淀。
注意事项
• 所有离心均在室温下进行。
• 加入 BufferP2 和 BufferP3 后，操作一定要温和，剧烈混合会导致质粒出现基因组DNA 污染。
• 使用前，将 RNase A 全部加入 Buffer P1中，混合均匀，2-8℃保存。
• 使用前检查 BufferP2，如有混浊，可 37℃加热至沉淀溶解。且使用后立即盖紧盖子，以免 pH 发生变化。
• 为了获得更高质量的质粒 DNA，建议严格控制加入菌液体积和各组分用量，菌体量过大会导致裂解和内毒素去除不充分，影响质粒 DNA 得率及纯度。当质粒 DNA 为低拷贝质粒 DNA、＞10kb 质粒 DNA 或菌液 OD 值较低时，可以适当增大菌液体积。不同量菌液所需试剂用量可参照下表：
| 菌液量 | Buffer P1 | Buffer P2 | Buffer P3 | Buffer ER |
| <100 mL | 5 mL | 5 mL | 5 mL | 1.5 mL |
| 100 mL-200 mL | 10 mL | 10 mL | 10 mL | 3 mL |
| 200 mL-300 mL | 15 mL | 15 mL | 15 mL | 4.5 mL |
| 300 mL-400 mL | 20 mL | 20 mL | 20 mL | 6 mL |
| 400 mL-500 mL | 25 mL | 25 mL | 25 mL | 7.5 mL |
• 洗脱体积不宜小于 1mL，过小的洗脱体积将影响洗脱效率。洗脱前，将洗脱用的Buffer EB 或 ddH2O 在 60-70℃预热后使用，洗脱效果会更好。
• 提取后的质粒 DNA 建议通过琼脂糖凝胶电泳检测提取质量(有无RNA、基因组DNA残留，质粒 DNA 超螺旋构象占比)，RNA或基因组 DNA 的残留影响质粒 DNA 定量准确性与下游应用。
• 当提取低拷贝质粒和>10 kb 质粒时，建议增大菌液投入量以获得更好的质粒 DNA产量。
