试剂盒采用加厚滤膜柱式提取和改良碱裂解方法相结合，适合于从 3~15ml 培养过夜的大肠杆菌培养液中提取高达 60 μg 高纯度质粒DNA。纯化的质粒可直接用于测序、酶切、PCR、转化、文库筛选，转染常规传代细胞等应用。本产品对碱裂解进行了优化，可以在20 分钟内完成数个样品提取工作。质粒产量纯度与宿主菌的种类、培养条件、拷贝数、质粒结构等因素相关。
产品信息
| 产品名称 | 货号 | 规格 |
| 质粒小中提试剂盒 | HSM010031-01 | 24T |
| HSM010031-02 | 100T |
产品组分
| Buffer | 3ml | 11ml | NaOH | 激活柱子 |
| BCL BufferP1 | 15ml | 60ml | Tris/ EDTA | 菌体重悬 |
| BufferP2 | 15ml | 60ml | NaOH/ SDS | 碱裂解 |
| BufferP3 | 20ml | 90ml | 盐酸胍/醋酸 | 结合液 |
| Buffer | 15ml | 60ml | 盐酸胍/异丙 | 除蛋白和 |
| PW1 Buffer | 6ml | 25ml | 醇 Tris/ | RNA 洗涤除盐离 |
| PW2 Elution Buffer | 10ml | 20ml | NaCl 10mMTris, pH8.5 | 子 洗脱液 |
| 纯化小柱 | 24 | 100 | 玻璃纤维滤 | 吸附核酸 |
| C6 2ml Collection | 24 | 100 | 膜 收集管 | 收集滤液 |
准备事项
1. 加入 0.5ml BufferP1 至 RNase A 干粉，吸打让RNaseA干粉溶解，然后全部转移BufferP1 中。若 RNaseA 是液体的，短暂离心后转移至 BufferP1 中，于 2-8℃保存，有效期为6 个月。
2. 按瓶子标签所示，加入 4 倍体积的无水乙醇稀释 BufferPW2，于室温保存。
实验流程
1. 菌体收集：转移 1~6ml 至 2ml 离心管中，10,000×g 离心 1 分钟，或 6~15ml 培养过夜的大肠杆菌培养液（LB 培养基）到 15ml离心管中。4,000×g 离心 10 分钟，倒弃培养液，反扣于吸水纸上轻轻拍打吸尽残液。培养方法：在无菌条件下，用灭菌牙签挑取一单菌落，转移 10~ 15ml 含相应抗生素的 LB培养基中，37℃摇床(200-300rpm)培养 12-14小时。培养瓶容量最好超过培养液体积的 4-5倍。2×YT 或 TB 培养液因菌体密度很高，菌液用量不应超过 6ml。2×YT 或 TB 培养液中菌体生长速度过快，不利于质粒充分复制，应尽量避免使用。纯化柱 C6 最大结合力为 60µg，高拷贝载体只需要用 10ml 培养过夜的菌液，超量的 DNA因无法吸附而随滤液流出。
2. 菌体重悬：加入 250µl 或 500µl BufferP1/RNaseA，涡旋让菌体充分分散。使用前确保 RNase A 已加到 BufferP1 中。充分重悬细菌对产量很关键，重悬后应看不到明显的菌块。若涡旋未能充分打散菌块，用移液器吸打数次。未打散菌块会影响裂解而造成产量和纯度降低。处理 7-15ml 菌液时，重悬后把溶液转移至 2.0ml 离心管中。从革兰氏阳性菌株中提取质粒时，加入 60mgLysozyme 至 Buffer P1，该溶液混合液可以2-8℃放置 6 个月。
3. 菌体裂解：往重悬液中加入 250µl 或500µl BufferP2，温和地上下翻转 6~8 次使菌体充分裂解，室温静置 3 分钟，期间上下翻转混匀 5-6 次。涡旋会造成基因组污染。混匀后溶液应变得粘稠而透亮。若溶液未能变得清亮，可能菌体过多而裂解不彻底，下次实验减少菌体用量或增加 BufferP1，BufferP2 和 BufferP3 用量。从富含核酸酶（Endo A+)菌株中提取质粒，先加入 20µl Proteinase K Solution，然后再加入 BufferP2。
4. 菌体中和：加入 350µl 或 700µl BufferP3，立即快速上下颠倒混匀 10~15 次让溶液中和。加入 BufferP3 后应立即快速上下颠倒混匀，以避免产生局部沉淀。当菌体用量较多或过量时，增加混匀次数以充分中和。
5. 去除杂质：13,000×g 离心 10 分钟。若离心后若有上清含有少量沉淀对后续实验没有影响。转移后上清液仍含有大量沉淀物，上下颠倒 3-5 次后再重复离心步骤。
6. 柱子激活：将纯化小柱 C6 装在收集管中，加入100µl BufferBCL 至柱子滤膜上，13,000×g 离心 60 秒，倒弃滤液把柱子装回收集管中备用。受湿气温度等贮藏条件影响，吸附柱最高结合力可能会下降，超过生产日期 6-8 个月或产量异常时才需要这一步。
7. 过柱纯化：把 750µl 上清液转移至纯化小柱 C6（已激活），13,000×g 离心 1 分钟。
8. （处理 6- 15ml 菌液）倒弃滤液，把柱子重新套回收集管中，把余下上清液移转移至柱子离心 1 分钟。
9. 除核酸酶：倒弃滤液，把柱子套回收集管中，加入 500µl BufferPW1 至柱子中，静置2 分钟，13,000×g 离心 1 分钟。
10. 脱盐：倒弃滤液，把柱子套回收集管中，加入 500µlBufferPW2 至柱子中。13,000×g离心 1 分钟。
11. 脱盐：倒弃滤液，把柱子套回收集管中，加入 500µlBufferPW2 至柱子中。13,000×g离心 1 分钟。
12. 干燥：倒弃滤液，把柱子套回收集管中。13,000×g 离心 2 分钟甩干柱子。
13. 洗脱：把柱子套在 1.5ml 离心管（自配）中。加入 60~100µl ElutionBuffer 或灭菌水至柱子的膜中央。13,000×g 离心 1 分钟洗脱DNA。柱子最低的洗脱体积为 60µl，低于 60µl 会导致洗脱效率下降。
14. 保存：弃去柱子，把质粒保存于-20℃。
OD 值测量和产量
（1）基座清洁：打开微量分光光度计，取 2ulElutionBuffer 或灭菌水加到基座上，将样品臂放下，浸泡 2 分钟，用无尘布将检测基座擦拭干净。把校准的 340nm 改为 320nm.
（2）调零：基座清洁后，加入 2ul ElutionBuffer 进行调零后，用滤纸吸去液体。
（3）测量：混匀样品，取 2ul 待测样品进行测量，用滤纸吸尽液体，进行第二个样品测量，最后用灭菌水清洗后完毕。本产品得到的质粒 DNA：A260/280 比值：本产品正常值为 1.80~ 1.95。若 A260/280 超过 2.0，说明存在 RNA 污染，请检查 P1/RNase A 有效期，或避免使用 2×YT 或 TB 等富含营养的培养液。处理低拷贝载体时，当核酸浓度＜80ng/µl 时，A260/280在 1.7-1.8 也是正常范围。A260/230 比值：本产品正常值为 1.9~2.4。若核酸浓度＜50ng/µl 时，低于这个数据也是可以，可以用 Buffer PW2 从一步清洗调整为两次清洗，有利于稳定 A260/230 的比值。
电泳检测
（1）配制 0.8-1.0%琼脂糖凝胶，取 0.5-1µg质粒 DNA(约 0.5-3µl )进行电泳分析。电泳后有时会出现三条或甚至三条以上的 DNA 条带，有时会有两条，甚至只一条带的情况。这种情况与电泳上样量、培养时间、质粒结构都有关系。
（2）电泳后经典的三条 DNA 条带是指超螺旋、线性 DNA 和开环 DNA，其中超螺旋最快，含量越高越好。
常见问题
1. DNA 产量低
（1）质粒拷贝数:载体因拷贝数差异会造成质粒产量明显的波动。高拷贝数的载体常有2~3 倍的产量波动，(每毫升培养过夜的菌液，高拷贝数的质粒载体产量为 3~16µg)。长片段质粒(>7KB)和表达型载体常以中低拷贝数为主，每毫升菌液的产量约为 0.5~2µg。
（2）菌种问题：菌种保存过程中存在质粒丢失现象，养菌前最好先划线活化，以稳定产量。
（3）细胞未充分裂解：细菌须在 BufferP1/RNase A 中充分重悬，成团的细菌因无法裂解会降低产量。
（4）试剂准备有误：BufferP2 若有沉淀析出需加热溶解。
2. 基因组 DNA 污染
（1）培养时间太长：菌液培养时间需控制在12~16 小时。
（2）裂解问题：加入 Buffer P2 时，必须轻柔颠倒混匀；处理多个样品时，从加入 BufferP2 时算起，总时间不要超过 4 分钟。
3. 下游实验结果不理想膜脱落：硅胶膜在离心过程中可能会发生脱落。脱落到质粒中硅胶膜是不溶解的。13,000×g离心 2 分钟后再把质粒转移至新的离心管中。
注意事项
本产品仅限于科学实验研究使用，不得用于临床诊断、治疗等领域。
