本试剂盒采用双抗体夹心法原理，并偶联生物素-链霉亲和素系统，用于定量检测样本中蛋白酶 K(Proteinase K)含量。酶标板微孔中包被抗蛋白酶 K 抗体，加入样本后孵育洗涤，再加入生物素化检测抗体孵育，形成抗体-抗原-抗体复合物，再次洗涤后加入辣根过氧化物酶(HRP)标记链霉亲和素(streptavidin， SA），经过彻底洗涤后加底物 TMB 显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，经酸的终止作用转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中蛋白酶 K 含量呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度(OD 值)，根据标准曲线计算样品中蛋白酶 K 浓度。
产品信息
| 产品名称 | 货号 | 规格 |
|---|---|---|
| 蛋白酶K检测试剂盒(ELISA法) | HBP008002-1 | 48T |
| HBP008002-2 | 96T |
产品性质
本试剂盒用于定量检测样本中蛋白酶 K 的含量。
运输及保存方法
1. 试剂盒于 2-8℃储存，避免强光直射，有效期 12 个月。
2. 包被条拆封使用后，应将剩余包被条密封，在 2-8℃储存，在有效期内使用。
3. 试剂盒其他组分使用后要及时放回到2-8℃条件，在有效期内使用。
试剂盒组成
| No. | 组分 | HBP008002- | HBP008002- |
|---|---|---|---|
| 1 | 反应板 | 6×18孔 | 12×28孔 |
| 2 | 生物素化检测抗体(100x) | 60μL | 120μL |
| 3 | HRP-链霉亲和素(100x) | 60μL | 120μL |
| 4 | 检测试剂稀释液 | 15mL | 30mL |
| 5 | 显色剂 | 6mL | 12mL |
| 6 | 终止液 | 3mL | 6mL |
| 7 | 浓缩洗涤(20x) | 15mL | 30mL |
| 8 | 标准品(1.6μg/mL) | 100μL | 200μL |
| 9 | 样本稀释液 | 25mL | 50mL |
| 10 | 封板膜 | 2张 | 4张 |
| 11 | 说明书 | 1份 | 1份 |
所需仪器和试剂
1. 酶标仪(含 450nm 波长，建议含有双波长检测模式，主副波长分别为450nm和650nm)。
2. 微孔板摇床。
检测流程图
实验前准备
1. 将本次实验所用试剂平衡至室温(18-25℃)
2. 20×浓缩洗涤液用纯化水按 1：19 体积比稀释成洗涤工作液。
3. 将抗体管、HRP-SA 管和标准品管在使用前1000 rpm 离心 30s，以避免管壁及管盖上残留试剂。
4. 将 100×生物素化检测抗体和 100×HRP-链霉亲和素在使用前用检测试剂稀释液作100 倍稀释后使用。
5. 蛋白酶 K 标准品(1.6μg/mL)用样本稀释液稀释至 16、8、4、2、1、0.5、0.25、0ng/mL。稀释方法建议如下：
检测步骤
1. 从室温平衡后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条加盖封板膜后用自封袋密封放回2-8℃。
2. 设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加入不同浓度的标准品 100μL，样本孔中加入待测样本 100μL。
*当不能够确定待测样品中的蛋白酶 K 含量时，可用样本稀释液做多个稀释倍数做检测。
3. 用封板膜封住反应孔，室温下振板(500rpm)反应 60min。
4. 弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液(250μL)，静置 30s，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板 4 次。
5. 标准品孔和样本孔中每孔加入工作浓度的生物素化检测抗体 100μL，用封板膜封住反应孔，室温下振板(500rpm)反应 30min。
6. 弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液(250μL)，静置 30s，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板 4 次。
7. 标准品孔和样本孔中每孔加入工作浓度的HRP-链霉亲和素 100μL，用封板膜封住反应孔，室温下振板(500rpm）反应 30min。
8. 弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液(250μL)，静置 30s，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板 4 次。
9. 每孔加入单组分底物显色液 100μL，用封板膜封住反应孔，室温静置避光反应 30min。
10. 每孔加入终止液 50μL，立即进行检测，设定酶标仪波长于 450nm 处(建议用双波长450nm/650nm）。
检测结果的解释
1. 计算标准品、空白对照、样本的平均光吸收值。以标准品浓度为横坐标，标准品光吸收值为纵坐标绘制标准曲线。(双波长检测模式下的光吸收值为 450nm 减去 650nm）
2. 推荐使用专业的曲线制作软件，如 curve expert 1.3 或 ELISA Calc (请使用 Logistic 五参数或四参数拟合曲线计算方法绘制标准曲线)等。
检测性能
1. 检出限：
0.05ng/mL
2. 定量限：
0.25ng/mL
3. 精密度：板内变异系数≤10%，板间变异系数≤15%
4. 回收率： 80%-120%
5. 线性范围：
0.25-16ng/mL
注意事项
1. 显色温度和时间对实验结果至关重要，应准确把握。若出现按常规操作流程，测值超出仪器可检测范围现象，可适当减少显色时间。
2. 洗涤过程中应使洗涤液浸泡反应板 30s 后再甩干，以充分洗涤非特异性吸附的成分。
3. 所有试剂使用前应充分摇匀，加样时应将所加样物加入酶标板孔中底部，避免加在孔壁上部，加样时注意不可溅出，不可产生气泡。
4. 若发现浓缩洗涤液中有结晶，可在 37℃水浴锅中孵育，待结晶完全溶解后再混匀稀释至工作浓度。
5. 样本中应避免引入叠氮化钠(NaN3），叠氮化钠会破坏辣根过氧化酶活性，使检测值偏低。
6. 不同批次组分的试剂不可以混用，移液器枪头不可混用，避免交叉污染。
7. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴好手套进行实验操作。
8. 本产品仅供科学研究使用，不得用于临床医学诊断及其他非合理用途。
