QuickCellPCR 法支原体检测试剂盒，本试剂盒采用一对支原体特异性引物，用于对样品的支原体基因组 DNA 进行 PCR 扩增，然后通过琼脂糖凝胶电泳对 PCR 产物进行检测。试剂盒内同时含有内参对照，用于监控 PCR 是否正常扩增。
本试剂盒是一种广谱的支原体检测试剂盒，可以识别所有 100 多种至今已发现的支原体；能用于检测一切可能含支原体的样品，比如：体外细胞培养的上清；血清；各种体液，如唾液、尿液、鼻腔分泌物等；其他液体样品等。具有 100%支原体识别率、灵敏度极高、含内参条带从而可以区分真阴性样品和假阴性样品、无需配套相对昂贵的荧光定量 PCR 仪等优点。
经多次测试，本试剂盒有记录可以识别在体外细胞培养中曾经报道出现的 20 种支原体，根据文献报道，这些支原体基本能占污染细胞的支原体种类的 100%。具体如下：（1）M.hyorhinis（2）M.fermentans(3)M.arginini (4)M.hominis (5)M.orale (6)M.salivarium (7)M.pirum (8)A.laidlawi(9)M.agalactiae (10) M.bovis (11) M.bovoculi (12) A.axanthum (13) M.buccale (14)M.pneumoniae (15) M. arthritidis (16) M.pulmonis (17) M. gallisepticum (18) M.gallinarum (19 ） M.canis (20 ）Ureaplasma urealyticum （ 注 :M. 为 Mycoplasma 的缩写;A.为 Acholeplasma 的缩写）。
产品信息
| 产品名称 | 货号 | 包装规格 |
|---|---|---|
| Quick Cell PCR 法支原体检测试剂盒 | HSC060021 | 100T |
产品组分
| 产品组分 | HSC060021 |
|---|---|
| 支原体引物和内参（100 次） | HSC060021-A 206 μL |
| 阳性支原体 DNA | HSC060021-B 50 μL |
| 去离子水 | HSC060021-C 1.8 mL |
注：以下试剂需要自行准备：①普通的 TaqDNA 聚合酶和相应的缓冲液；②2.5mM 的 dNTP；③DNA 上样缓冲液。
使用说明
1.待测样品的准备
取换液后培养 2-3d 且汇合度在 90%左右的细胞培养液上清（贴壁细胞）。悬浮培养的细胞在换液传代后，生长 2-3d 再取培养液进行检测。可以按照以下两种方法之一进行样品的前处理：
方法一
(1)取 150 μL 上述待测样品到 1.5 mL 离心管内，在普通台式离心机上 1000rpm 低速离心 5min;
(2)上述离心上清液，95℃加热处理 5min（可以转移到 PCR 管内，在 PCR 仪上进行加热处理），简单离心（1000g，5s）后，取上清进行检测。
方法二（推荐本方法，有高速离心机的的可选用本方法，可以去 PCR 抑制物，准确性更高。）
(1)根据浓缩倍数，可以取 100-1500 μL 上述待测样品到 1.5 mL 离心管内，普通台式离心机 1000rpm 离心 5min，将离心后的上清转移到另一个离心管内，丢弃细胞沉淀。
(2)将上清继续 13000rpm（约 16000g）高速离心 5min，小心吸走全部上清，用 50μL 5mMTris-HCl,pH8.5 推荐使用，样品可以长期保存）或者去离子水（样品比较不稳定，只适合当天或短期内检测使用）重悬、沉淀（沉淀中含有支原体），吹吸均匀。
(3)该重悬后的样品可以直接检测，也可以进行热处理后再检测（热处理后，样品保存更稳定）。热处理具体如下：95°C 加热处理 5min（可以转移到 PCR 管内，在 PCR 仪上进行加热处理），简单离心（1000g，5s)后，取上清进行检测。
注：①这里的细胞培养上清不是指细胞经胰酶消化后的离心上清，而是指至少培养 2d 后的贴壁细胞培养液上清或悬浮细胞培养液；②本步骤的低速离心是为了去除哺乳动物细胞，以排除其不必要的干扰。所以离心力要严格控制在 150-200g，该离心力下，哺乳动物细胞将被沉淀下来而支原体不会；③收集的待测细胞培养液样品如果不立即检测，请放于-20℃或-80C 冰箱保存；④如果预期待测样品支原体含量较少（比如低温保存的血清、脐带血、胰酶、抗生素、未使用的培养液、生物制品、极个别细胞培养上清等），可以采取措施以提高检测的灵敏度，具体方法请看后文注意事项部分：如何提高本试剂盒检测灵敏度。
2. PCR 体系的配制
(1)按照 25 μL 体系配制比例如下。如果是多样品检测，加两个对照样品后各组分总体积如下表。配制好的混合液，按每管 23 μL 分装到 0.2mL 的 PCR 管中。
| 组分 | 单个一批体积（μL） | 样品总数 | 总体积 |
|---|---|---|---|
| 去离子水 | 16.375 | N | 16.375×(N+2)×1.06 |
| 10×Taq Buffer（含 Mg2+） | 2.5 | N | 2.5×(N+2)×1.06 |
| 2.5mM dNTP | 2 | N | 2×(N+2)×1.06 |
| Taq(5U/μL) | 0.125 | N | 0.125×(N+2)×1.06 |
| 支原体引物和内参 | 2 | N | 2×(N+2)×1.06 |
注：①总体积中多配制 6%是为了防止移液导致误差，以保证每个反应管中的反应液足量；②如果有条件，PCR 体系的配制最好在冰上进行操作；③本试剂盒不推荐使用 2×的 PCR mixture(内含 Taq 酶、缓冲液和 dNTP)，建议使用 Taq 酶、10×Taq 缓冲液和 dNTP 等试剂配制 PCR 体系；④为了避免可能的污染，收到的支原体引物和内参，可以适当分装（比如：每支 40 μL）后冷冻保存；⑤如果使用的是其他 Taq 酶（前提是：阴性对照的 586bp 内参条带必须有一定亮度，且稳定性良好，否则不能使用），酶、去离子水的加入量需要根据其说明书进行调整。
(2)加入待测样品、阴性和阳性对照样品。样品检测管中加入 2 μL 待测样品，阴性对照管加入 2 μL 去离子水，阳性对照管加入 2 μL 阳性支原体 DNA。
注：①装有阳性支原体 DNA 的螺口管开盖之前，低速离心或用手指捏住，用力甩一下即可；②进行反应体系配制的房间，与样品前处理、加阳性对照 DNA、样品 DNA 的房间最好分开。
3. PCR 参数设置
| 1 cycle | 94℃ | 2 min |
| 40 cycles | 94℃ | 15 ses |
| 55℃ | 15 ses | |
| 72℃ | 45 ses | |
| 1 cycle | 72℃ | 5 min |
| 1 cycle | 8℃ | forever |
4. PCR 产物琼脂糖凝胶电泳
配制含 GelRed 核酸染料（10,000× in water）的浓度为 1.5%的 DNA 琼脂糖凝胶；当溴酚蓝染料跑出上样孔 3-4cm 时，停止电泳，拍照。
5. 结果判断
注：“-”代表没有条带；“+”代表有条带；“+”号越多代表条带越强。支原体 PCR 扩增结果：586bp 条带为内参条带，270bp 左右的条带为支原体特异条带（各支原体的条带大小会略有不同，总体在 266-280bp 之间。注意：支原体特异条带的大小不会超过该范围。超过该范围的，就是杂带！）。随着支原体 DNA 模板的增加，270bp 左右的条带会逐渐增强而 586bp 的内参条带会逐渐减弱，甚至消失。
泳道 1：阴性对照或者没有支原体污染的样品；
泳道 2：极重度支原体污染样品；
泳道 3：重度污染样品；
泳道 4：中度污染样品；
泳道 5：轻度污染样品；
泳道 6：PCR 的扩增被细胞的代谢产物抑制，导致扩增失败。
M:DNA marker
| 电泳结果 | 泳道1 | 泳道2 | 泳道3 | 泳道4 | 泳道5 | 泳道6 | 泳道M |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 586bp 内参条带 | ++ | - | + | ++ | ++ | - | Mark |
| 270bp 支原体特异条带 | - | ++++ | +++ | ++ | + | - | |
| 支原体污染判断 | 阴性 | 极重度污染 | 重度污染 | 中度污染 | 轻度污染 | PCR 被抑制 |
注意事项
• 本产品主要用于细胞上清支原体污染检测，仅限于科学实验研究使用，不得用于临床诊断、治疗等领域。
• 设有阴性对照，保证本试剂盒含有的支原体引物和内参以及整个反应体系正常。
• 只有当阴性对照的结果没有出现 270bp 左右的支原体特异条带时，其他样品的检测结果才是可信的。
• 每次试验阴性对照中 586bp 的内参条带都必须出现而且要有一定的亮度，才说明试验成功。如果阴性对照的内参条带经常没有出现或者非常弱，说明试验不成功，这时可以采取以下几个措施：a.请使用普通蒸馏水或去离子水。不能使用去内毒素的水、DEPC 处理的水或者商品化的 DNase/RNase-free 的水，这几种水都可能会抑制 PCR 扩增的效率。b.可尝试增加 PCR 的循环数，比如：由原来的 40 个循环，增加到 45 个循环。
• 如果直接使用细胞培养液上清进行检测，而检测结果显示该样品 586bp 条带和 270bp 左右的条带都没有出现（如图电泳图，泳道 6）或者内参条带非常微弱，在排除 PCR 试剂的问题后，说明该样品含有抑制 PCR 扩增的代谢产物。
• 防 DNA 污染注意事项：a.强烈建议所有操作全部使用进口滤芯吸头（比如：Axygen 滤芯吸头）进行操作，以免试剂被污染。b.“PCR 体系配制的房间、移液枪”（不要使用细胞培养室的移液枪！）和“PCR 产物的电泳房间、移液枪”一定要分开，不能在同一个房间进行，也不能使用相同的移液枪进行操作。C.PCR 产物是导致假阳性的最主要原因，PCR 产物不要在 PCR 体系配制的房间中打开。d.样品处理的房间和移液枪，如有条件，最好也分开。e.收到的支原体引物和内参，可以分装（比如 40uL 一支）后保存。
• 支原体检测样品可以分成两类：第一类，用含血清的培养液培养的哺乳动物细胞上清液，由于该条件非常适合支原体生长，培养数天后，支原体密度一般较高，可达 107-9/mL，可以直接检测。第二类，低温保存的血浆、血清、脐带血、胰酶、抗生素、未使用的培养液等样品，由于这些样品即使有支原体污染，支原体含量一般很少，直接使用快速支原体检测试剂盒进行检测，往往检测不出来。这些样品建议：（1）对样品的支原体进行离心浓缩处理；（2）使用支原体液体培养基（必须同时接种不含精氨酸和含精氨酸的两种支原体液体培养基）培养 3-7d 后，再进行检测。具体方法请参考 QuickCell 发光法支原体检测试剂盒说明书中最后的注意事项部分。该方法速度较慢，需要 3-7d，但是可靠性高。
