重组 C 因子内毒素检测试剂盒是可替代传统鲎试剂用于人用和动物用注射药物(如化学药品、放射性药物、抗生素类、生物制品等)及医疗器械(如透析液、植入式器械等)的原辅材料、中间产品、放行产品的内毒素检测。本试剂盒是一种不依赖于动物源性成分，灵敏度高、特异性高、可稳定且持续提供的替代鲎试剂的内毒素测定产品，可测量 0.005-5EU/mL 的内毒素浓度范围。
产品信息
| 产品名称 | 货号 | 规格 |
|---|---|---|
| 重组C因子内毒素检测试剂盒 | HBP008001-1 | 48T |
| HBP008001-2 | 96T |
检验原理
鲎 C 因子是鲎血细胞中一种对细菌内毒素敏感的丝氨酸蛋白酶原，在细菌内毒素介导的鲎血凝集系统中，鲎 C 因子第一个被内毒素激活而启动整个鲎血细胞中的血凝级联反应。重组 C 因子是以基因重组的方式表达的 C 因子重组蛋白 ( Recombinant FactorC, rFC），通过内毒素结合并激活的重组 C 因子能够切割底物获得游离的荧光基团，荧光基团的释放与内毒素的浓度呈正比，从而使得内毒素被定量检测。与经典的鲎试剂内毒素检查方法相比，重组 C 因子内毒素检测法具有更高的特异性，更好的专属性、精密度、准确度、线性范围及定量限，是目前鲎试剂内毒素检测方法的改良方法。
主要组成成分
| 组分 | 48T | 96T |
|---|---|---|
| 荧光底物溶液 | 3mL | 6mL |
| 测定缓冲液 | 2.5mL | 5mL |
| rFC酶溶液 | 0.6mL | 1.2mL |
| 无热原水 | 30mL | 30mL |
| 内毒素工作标准品 | 1瓶 | 2瓶 |
| 解蔽缓冲液1 | 10mL | 10mL |
| 解蔽缓冲液2 | 10mL | 10mL |
| 96孔无热原可拆卸反应板 | 1块 | 1块 |
运输及保存方法
2-8℃运输。收到试剂盒后，请立即置于 2-8℃储存。未开封的试剂盒有效期为 6 个月。内毒素工作标准品溶解后 2-8℃储存，有效期最长 8 周。
所需耗材与设备
一次性无热原玻璃稀释管（用于内毒素工作标准品稀释）；无菌无热原的移液器与吸头；漩涡振荡器；计时器；可进行荧光检测(波长设置为 380nm/440nm)的酶标仪。
操作简介
该测定在 96 孔板中进行，加样后分别在零小时和在 37 ℃ ± 1 ℃ 孵育 1 小时后使用380nm/440nm 的激发/发射波长测量荧光值。用阴性对照的荧光差值（ΔRFU）对工作标准品和样品的荧光读数差值（ΔRFU）进行校准得到净荧光差值。净荧光差值的对数与内毒素浓度的对数呈比例，且在 0.005 至 5.0EU/mL范围内呈线性。根据标准曲线可以计算样品中的内毒素浓度。试剂盒使用操作流程如下图：
实验前准备
1. 样品准备
(1) 待测样品应小心处理以避免微生物或内毒素污染。所有与样品或测试试剂直接接触的材料均应无热原；样品稀释要在无热原玻璃稀释管中用无热原水进行；若不及时检测，建议冷藏或冷冻保存。
(2) 待测样品的 pH 值需要维持在 6-8 之间。若样品的 pH 值不在此范围内，则需要使用无内毒素的氢氧化钠、盐酸或其它缓冲溶液进行调节。注意：待测样品不能直接进行 pH 调节，以免被 pH 电极污染内毒素导致假阳性，务必预实验考察适宜的 pH 调节方法。
(3) 对内毒素检测无干扰(增强或者抑制）的样品不稀释可直接用于检测；对内毒素检测有干扰的样品需稀释至不干扰检测的浓度，稀释过程应充分漩涡震荡≥1min；通常内毒素检测干扰是由于样品中组分的浓度过高，因此大多数情况下，通过适度的稀释能够克服对内毒素检测的干扰。
(4) 使用试剂盒检测样品前需进行适用性研究。通过考察样品内毒素检测的加标回收率来确定样品是否对检测有干扰，若发现样品对检测具有干扰，则需要对该样品进一步进行预处理(调解 pH 值、稀释等），直到克服干扰问题。
(5) 样品的稀释倍数应小于样品的最大有效稀释倍数，样品最大有效稀释倍数（MVD）的计算公式如下：MVD=内毒素限度（EU/mL）/测定灵敏度（0.005EU/mL），其中内毒素限度是未稀释样品中可接受的内毒素浓度最大值，测定灵敏度是测定试剂的最低检测限度（本试剂盒的最低检测限度为 0.005EU/mL）。
2. 荧光酶标仪的灵敏度设置
(1) 荧光信号通常记录为相对荧光单位(RFU)。由于真实的荧光信号被转换为电子信号，该电子信号可使用增益设置或灵敏度设置进行调整，因此 RFU 是一种任意单位。根据检测到的信号强度，可以将仪器调整到更高的增益/灵敏度设置，以增强微弱信号，或者在信号太强时将仪器调低到较低的增益/灵敏度设置。在 rFC 法进行内毒素检测的试验中，lg(ΔRFU)与 lg(内毒素浓度 EU/mL)相对应，如果灵敏度调得过低，将很难检测到最低标准的荧光；如果灵敏度调得过高，最高标准的荧光将超出检测范围。因此进行试验前，必须确定合适的检测灵敏度。例如，BioTeckSynergyH1 酶标仪的荧光范围是 0-99999。为了所有点的荧光都落在检测范围内，0.5EU/mL 的 RFU 范围应为 1000-10000，对应 RFU 的对数范围为 3-4，对数中点是 3.5。因此，0.5EU/mL 的目标绝对净 RFU 大约为 3000RFU。为了让日常检测试验中的阴性对照与最低标准之间保持足够大的间隔，可将 3000 RFU 视为 0.5EU/mL内毒素浓度的最小值。注：由于不同品牌酶标仪搭载的软件差异，建议用户参阅酶标仪用户手册中的使用说明。
检验步骤
1. 溶解内毒素工作标准品
(1) 在内毒素工作标准品冻干粉中按照产品标签加入对应体积的无热原水，得到20EU/mL 的溶液，漩涡震荡≥15min。
注意：①每次移液步骤都要使用新的移液器吸头，以避免污染剩余试剂；②配制后冷藏的内毒素工标准品，取出使用前需平衡至室温后漩涡震荡≥15min，方可用于检测。
2. 制备内毒素工作标准品溶液
(1) 取用 4 支一次性无热原玻璃稀释管，在瓶身标明内毒素工作标准品溶液浓度（分别 0.005、0.05、0.5 及 5EU/mL），用溶解至20EU/mL 的内毒素工作标准品溶液制备系列内毒素标准品溶液，建议以梯度稀释方法稀释内毒素工作标准品，如下表所示：
| 内毒素标准品浓度 | 无热原水加量 | 内毒素工作标准品加量 |
|---|---|---|
| 5.0 | 0.75 | 0.25mL20EU/mL溶液 |
| 0.5 | 0.9 | 0.1mL5EU/mL溶液 |
| 0.05 | 0.9 | 0.1mL0.5EU/mL溶液 |
| 0.005 | 0.9 | 0.1mL0.05EU/mL溶液 |
注意：①由于内毒素会吸附于塑料管壁，请勿使用塑料管稀释内毒素；②进行稀释之前应将用于稀释的上一浓度内毒素工作标准品溶液充分漩涡震荡（1400rpm）≥1min，如在准备制备 5EU/mL 内毒素标准品时，先将20EU/mL 内毒素工作标准品溶液充分漩涡震荡≥1min；在准备制备 0.05EU/mL 内毒素标准品时，先将 0.5EU/mL 内毒素工作标准品溶液充分漩涡震荡≥1min；③稀释后的内毒素标准品溶液需尽快使用。
3. 加样至测定板
(1) 将 100μL 阴性对照(无热原水）、内毒素工作标准品溶液、样品(两组)分别加入到96孔无菌无热原反应板相应孔中，通常需要两复孔或三复孔。在两组样品孔其中一组中加入 10 μL 5EU/mL 的内毒素工作标准品溶液作为加标样品组。
注意：①每次样品检测需同时进行内毒素工作标准溶液检测，绘制新的标准曲线；②建议每个样品均加标。
4. 配制底物试剂
(1) 内毒素工作标准品溶液配制期间可同时配制底物试剂。底物试剂制备前，提前 30min取出荧光底物溶液、测定缓冲液和 rFC 酶溶液，使各试剂温度平衡至室温。
(2）配制底物试剂，按照 5:4:1 的比例混合荧光底物溶液、测定缓冲液和 rFC 酶溶液，轻轻地充分混合，切勿漩涡混合。
注意：①按照依次吸取荧光底物溶液、测定缓冲液和 rFC 酶溶液的顺序加入底物试剂至配制容器中，确保 rFC 酶溶液最后加入；②底物试剂请现配现用，切勿一次配制过多。
5. 加入底物试剂及荧光检测
(1) 设置酶标仪检测参数：激发波长 380nm，发射波长 440nm。
(2) 使用移液器向所有样品孔中加入底物试剂，100μL/孔，移液时注意更换吸头，避免污染剩余试剂。
(3) 底物试剂加入后，立即读取时间点零小时的荧光值。
(4) 将 96 孔板放在 37℃±1℃ 培养箱中，孵育 1 小时后进行时间点 1 小时的荧光值读数。
6. 数据分析
(1) 将酶标仪读取的荧光值（时间点零小时和时间点一小时）导出到电子表格中。
(2) 所有孔从时间点一小时荧光值中减去时间点零小时荧光值（ΔRFU）。
(3) 从标准品和样品ΔRFU 数据中减去阴性对照孔的ΔRFU，得到标准品和样品的净ΔRFU值。
(4) 计算内毒素工作标准品平均净ΔRFU 和浓度（EU/mL）的对数。
(5) 以内毒素工作标准品溶液浓度的对数为横坐标，净ΔRFU 的对数为纵坐标绘图并进行线性拟合，lg(净ΔRFU)=A*lg(内毒素浓度EU/mL)+B，标准曲线的相关系数 R2 的值应≥0.980，斜率 A 范围为 0.8~1.1。
(6) 计算样品及加标样品的内毒素浓度，计算加标回收率（加标回收率%=（内毒素浓度加标- 内毒素浓度未加标） / 加标内毒素浓度 0.5EU/mL×100%），若加标回收率在 50%-200%之间则认为样品对检测无干扰，检测结果可靠。
(7) 对加标回收率合格的样品，根据样品的稀释倍数计算未稀释样品的内毒素浓度。
检测限
测定范围：0.005-5EU/mL
注意事项
(1) 重组C因子内毒素检测试剂盒仅用作样品的体外内毒素检测，不能用于临床诊断和治疗。
(2) 内毒素检测过程中与测定试剂接触的耗材务必使用明确无菌无热原产品，避免污染测定试剂。
(3) 使用前，让所有试剂自然平衡至室温（20-25℃）。
(4) 采用低吸附移液吸头，每次进行移液步骤操作时都要使用新的移液器吸头，以避免污染剩余试剂。
(5) 采用合适的校准移液器，尽可能保证所有小体积液体的精确转移。
(6) 不同批次的试剂不得混合后使用。
常见问题及解决方法
(1) 样品检测没有信号的可能原因及相应的解决措施：①移液错误：重新检测；②干扰成分：加标预实验或者每次实验的加标回收率不合格，显示干扰，对样品进行稀释或排除干扰；若稀释不能解决加标回收率不合格的情况，可使用试剂盒中配备的解蔽缓冲液 1 或解蔽缓冲液 2 对样品进行稀释，尝试解决样品加标回收率不合格的问题；用无热原水稀释样品可以解决时，不建议使用配备的解蔽缓冲液进行稀释；③不适当的 pH：检测样品 pH 值，调节至 6-8 的中性范围。
(2) 检测信号强度低的可能原因及相应的解决措施：①仪器灵敏度（增益）太低：提高敏感度，需要更高的增益；②酶标仪检测参数设置错误：检查运行仪器设置参数；③孵育温度太高/太低：检查及校准温度；④试剂失效（运输或储存）或过期：检查储存条件和包装材料；联系技术服务，使用新试剂盒或新试剂。
(3) 标准品孔和阴性对照孔中的检测背景值高的可能原因及相应的解决措施：测定组分（底物试剂、测定缓冲液或 rFC 酶溶液）有污染：用新开封试剂、务必采用无菌无热原吸头。
(4) 标准曲线线性不好的可能原因及相应的解决措施：①内毒素工作标准品溶液稀释误差：重新精确稀释；②酶标仪荧光检测灵敏度低导致 5EU/mL 时的荧光值超出仪器检测范围：换用荧光检测灵敏度高的酶标仪。
