三代逆转录可选引物预混液（去基因组）是一款高效、便捷、减少污染的高质量一链 cDNA 合成预混液，包含 M-MLV GIII Reverse Transcriptase 及其反应 Buffer、RNA 酶抑制剂、dNTPs 等一链 cDNA 合成所需的多种组分，还需加入 RNA 模板、引物和水即可开始反应，操作非常方便。针对不同实验设计可灵活使用不同类型的逆转录引物，满足多样化的实验需求，可根据不同实验场景选择 Oligo(dT)20VN 或 Random hexamers 或 Gene Specific Primers。使用该逆转录预混液 15 分钟内最长可获得 12 kb 大小的 cDNA。
从细胞中提取的 RNA 往往存在基因组 DNA 污染，如果逆转录前不将其去除，下游 qPCR 反应时基因组 DNA 与 cDNA 会同时被扩增（尤其当引物设计在同一外显子上时），从而影响基因表达定量准确性。本试剂盒采用 dsDNase 高效去除基因组 DNA 污染，dsDNase 能够特异性消化双链 DNA（dsDNA 或 DNA-RNA 杂合链中的 DNA 链），并且具有热敏感性，在逆转录温度下即可快速不可逆地失活。与传统使用 DNase I 去除基因组 DNA 污染的方法相比，dsDNase 无需额外加入 EDTA 进行失活，不仅节省实验时间，而且降低了对逆转录反应的抑制。
产品信息
| 产品名称 | 货号 | 规格 |
| 三代逆转录可选引物预混液（去基因组） | HSM080041 | 100rxn |
产品组分
| 组分 | 规格 |
| 三代逆转录可选引物预混液（去基因组） | HSM080041A 400 μL |
| dsDNase | HSM080041B 2×50 μL |
| 10× dsDNase Buffer | HSM080041C 200 μL |
| Nuclease-Free Water | HSM080041D 2×1 mL |
| Oligo(dT)20VN(50 μM) | HSM080041E 100 μL |
| Random hexamers(50 μM) | HSM080041F 100 μL |
使用方法
1.Total RNA
基因组去除
①反应体系按下表配置（冰上操作）：
| 组分 | 使用量 |
| Total RNAa | 50 ng~1 μg |
| dsDNase | 1 μL |
| 10× dsDNase Buffer | 1 μL |
| Nuclease-Free Water | To 10 μL |
a. 推荐使用试剂盒提取的高质量 RNA 作为模板。
②轻柔吸打混匀，瞬离；
③37℃孵育 2 min，去除基因组 DNA 污染；
注：若 RNA 中基因组 DNA 污染严重，可适当延长 37℃孵育时间至 5 min。
④65℃孵育 2 min，使 dsDNase 失活，冰上放置。
2.第一链 cDNA 合成
①反应体系按下表配置（冰上操作）：
| 组分 | 使用量 |
| “实验①”反应产物 | 10 μL |
| 三代逆转录可选引物预混液（去基因组） | 4 μL |
| Oligo(dT)20VN（50 μM） 或 Random hexamers（50 μM） 或 Gene Specific Primers（50 μM） | 1 μL 1 μL 0.1 μL |
| Nuclease-Free Water | To 20 μL |
②轻柔吸打混匀，瞬离；
③55℃孵育 15 min；
注：若目标 RNA 不含 Poly(A)结构，可预先 25℃温育 10 min。
④反应结束后，85℃孵育 5 min，以终止反应；
⑤将获得的 cDNA 溶液置于冰上，用于后续实验；或立即保存于-20℃。
注：1.后续实验为克隆实验，若 RNA 来源于真核生物，只需使用 Oligo(dT)20VN 即可，加入 Random hexamers 会降低全长 cDNA 的产量；若 RNA 来源于原核生物，只需使用 Random hexamers 或 Gene Specific Primers。2.后续实验为 qPCR，请同时加入 Oligo(dT)20VN 和 Random hexamers 以获得在 mRNA 不同位置逆转录效率均一的 cDNA。
2.miRNA
基因组去除
①反应体系按下表配置（冰上操作）：
| 组分 | 使用量 |
| miRNAa | 10 pg~200 ng |
| dsDNase | 1 μL |
| 10× dsDNase Buffer | 1 μL |
| Nuclease-Free Water | To 10 μL |
②轻柔吸打混匀，瞬离；
③37℃孵育 2 min，去除基因组 DNA 污染；
注：若 RNA 中基因组 DNA 污染严重，可适当延长 37℃孵育时间至 5 min。
④65℃孵育 2 min，使 dsDNase 失活，冰上放置。
2.第一链 cDNA 合成
①反应体系按下表配置（冰上操作）：
| 组分 | 使用量 |
| “实验①”反应产物 | 10 μL |
| 三代逆转录可选引物预混液（去基因组） | 4 μL |
| Stem-loop primer（5 μM）b | 1 μL |
| Nuclease-Free Water | To 20 μL |
b:茎环引物推荐终浓度 0.25 μM，可在 0.1~0.5 μM 范围内进行调整。
②轻柔吸打混匀，瞬离；
③55℃孵育 15 min；
④反应结束后，85℃孵育 5 min，以终止反应；
⑤将获得的 cDNA 溶液置于冰上，用于后续实验；或立即保存于-20℃。
miRNA 茎环引物及 qPCR 引物设计
1.Stem-loop RT 引物设计：基于通用的茎环结构，只需要按照不同的 miRNA 序列修改最末端 6 个碱基即可。通用茎环结构序列为：
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCG
CACTGGATACGAC；
2. 以 miR-1-5p 为例，其序列为
CAUACUUCCUUACAUGCCCAUA，只需在通用茎环序列后加上 miRNA 3'末端的 6 个碱基的反向互补序列，即
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCG
CACTGGATACGAC“TATGGG”；
3.qPCR 上游引物设计：miRNA 序列除去 3'端 6 个碱基的剩余部分作为上游引物，如 miR-1-5p 的上游引物为（注意把 U 改为 T）：
CATACTTCCTTACATG。检查引物的 Tm 值，如果 Tm 值较低，则在 5'端加 GC 使 Tm 值接近 60℃。因此 miR-1-5p 的上游引物可设计为：
GCCGCCATACTTCCTTACATG，60.3℃；
4. 下游引物是通用的，序列为
GTGCAGGGTCCGAGGT；
5.引物设计好后，需要通过预试验检测引物的特异性。一般需要做熔解曲线来检测引物的特异性；同时最好将 PCR 产物进行电泳检测产物是否单一（产物长度很短，需要 3%以上的琼脂糖胶）。
注意事项
1.所有试剂使用前请轻轻上下颠倒混匀，尽量避免起泡，并经短暂离心后使用；
2.为了防止 RNase 污染，请保持实验区域洁净；
3.操作时需穿戴干净的手套、口罩；
4.实验所用的离心管、枪头等耗材均需保证 RNase-free。
