视黄酸诱导基因-I（RIG-I）是一种胞质病原体识别受体，可启动针对许多 RNA 病毒的免疫反应。RIG-I 属于 RNA 解旋酶的 DExD/H 家族，与所有解旋酶一样，RIG-I 具有 ATP 酶活性，与 dsRNA 结合后，其 ATPase 酶活被激发，将 ATP 水解为 ADP + Pi。本试剂盒通过检测 RIG-I 和样本反应过程中产生的 ADP 量来测定样本中 dsRNA 的含量。测定在多孔板中进行，可在低至 5μL 的反应体积内检测。检测分三步进行：首先，将 RIG-I 酶、ATP 与样本混合孵育启动反应。在反应后，加入等体积的试剂 1 耗尽剩余的 ATP。最后，加入试剂2，将 ADP 转化为 ATP，并利用萤光素酶/萤光素反应测量新生成的 ATP。产生的发光信号用酶标仪测量。根据标准曲线，可计算样本中dsRNA 含量。
产品信息
| 产品名称 | 货号 | 规格 |
|---|---|---|
| RIG-I dsRNA检测试剂盒 | HBP003805-1 | 96T |
| HBP003805-2 | 384T |
产品性质
本试剂盒通过检测 RIG-I 与样本反应产生的ADP 量来定量测定样本中 dsRNA 的含量。
运输及保存方法
1. 干冰运输。收到产品后请立即置于-25~-15℃储存。
2. 使用前，先将所有组分置于室温条件下完全解冻混匀。未使用完的组分进行分装，并置于-25~-15℃储存。RIG-I 体系、试剂 1 现用现配，试剂 2 可在室温（18~25℃）下放置 24小时，信号没有显著损失。
试剂盒组成
| 类别 | 组分名称 | 96T | 384T |
|---|---|---|---|
| RIG-I ATP酶反应 | RIG-I酶（1μM） | 100μL | 400μL |
| RIG-I 反应缓冲液（10×） | 0.25mL | 1mL | |
| 1M DTT | 20μL | 50μL | |
| 10mM ATP | 25μL | 100μL | |
| dsRNA标准品(无修饰， 25ng/μL) | 40μL | 150μL | |
| dsRNA标准品(N1-Me-pUTP修饰，25ng/μL) | 40μL | 150μL | |
| ADP检测 | 试剂1-缓冲液 | 0.5mL | 2mL |
| 试剂1-酶（5×） | 0.125mL | 0.5mL | |
| 试剂1-0.5M MnCl2 | 25μL | 100μL | |
| 试剂2 | 1.25mL | 5mL | |
| 检测板 | 384孔板 | 1 | 1 |
| 说明书 | 1 | 1 |
所需仪器和耗材
1. 化学发光酶标仪
2. 恒温培养箱、振荡器
3. 掌上离心机
4. 微量移液器
5. RNase-free 枪头和 EP 管
检测流程图
实验前准备
1. 使用前将所有试剂解冻平衡至室温（18~25℃），解冻后彻底混匀所有组分。
2. 试剂避免反复冻融，可分装成等量试剂并保存在-25~-15℃。
3. RIG-I 反应缓冲液（1×）用于 RIG-I、ATP、样本的稀释，使用前需根据所需量现用现配。以配制 1000μLRIG-I 反应缓冲液（1×）为例： 895μL 无核酶水中加入 100μL RIG-I 反应缓冲液（10×）和 5μL 1M DTT，混匀后使用。 DTT 的工作浓度为 5mM。
4. 试剂 1 由三组分构成，使用时需根据所需量现用现配，以配制 100μL 试剂 1 为例：1μL 0.5M MnCl2 加 9μL 试剂 1 缓冲液稀释成50mM MnCl2，78μL 缓冲液中加入 20μL 5x酶液和 2μL 50mM MnCl2，混匀后使用。酶的工作浓度为 1x，MnCl2 工作浓度为 1mM。
检测步骤
1. 将实验所需试剂平衡至室温（18~25℃）
2. 配制 RIG-I 反应缓冲液（1×），以 1mL 为例：
| 组分 | 体积 |
|---|---|
| RIG-I 反应缓冲液（10×） | 100μL |
| 1M DTT | 5μL |
| 无核酶水 | 895μL |
*RIG-I 反应缓冲液工作浓度为 1×，DTT 的工作浓度为 5mM。
*可根据所需量按比例放大或缩小配制量。
3. 准备 RIG-I、ATP mix，以 100μL 为例：用 RIG-I 反应缓冲液（1×）稀释 RIG-I 和 ATP
| 组分 | 体积 |
|---|---|
| RIG-I 反应缓冲液（1×） | 88μL |
| 1μM RIG-I酶 | 10μL |
| 10mM ATP | 2μL |
*RIG-I 酶工作浓度为 0.1μM，ATP 工作浓度为
0.2mM。
*可根据所需量按比例放大或缩小配制量。
4. 稀释标准品和样品：用 RIG-I 反应缓冲液（1×）稀释标准品和样品，标准品稀释至 2.5μg/mL、1.25μg/mL、
0.625μg/mL、0.3125μg/mL、0.156μg/mL、
0.078μg/mL、0.039μg/mL、0.0195μg/mL、 0μg/mL。样本检测建议浓度为 0.2mg/mL~0.01 mg/mL。
5. 将 RIG-I、ATP mix 与标准品/样本 5μL： 5μL 等体积混匀，37℃恒温孵育 60min。
6. 孵育即将结束，ADP 检测前准备试剂 1，以 100μL 为例：
| 组分 | 体积 |
|---|---|
| 试剂 1-缓冲液 | 78μL |
| 试剂 1-酶（5×） | 20μL |
| 试剂 1-0.5M MnCl2 | 2μL 50mM MnCl2 |
*酶工作浓度为 1×， MnCl2 工作浓度为 1mM。
*可根据所需量按比例放大或缩小配制量。
7. 取 5μL 反应后的混合液、5μL 试剂 1 加入到检测板反应孔中，混匀，室温孵育 60min。
8. 每孔加入 10μL 试剂 2，混匀后室温孵育40min。用多功能酶标仪进行化学发光检测，每孔检测时间为 0.25~1s。
注意事项
1. 在加入 ADP 检测试剂之前，应将检测板和试剂平衡至室温。如果平衡不充分，可能会导致平板中心孔和边缘孔之间出现温度梯度，从而导致板不同孔间存在差异。
2. 建议使用适合发光检测的纯白色微孔板，减少相邻孔间的信号串扰。对于 384 孔板，我们建议使用 5μL RIG-I 反应体系、5μL 试剂 1和 10μL 试剂 2，总体积为 20μL。也可以使用其他体积，但应保持 RIG-I 体系与试剂 1 和试剂 2 体积比为 1: 1: 2。
3. 试剂盒中含有多种酶，反复冻融会导致逐渐失活，第一次解冻后可适当分装。试剂中少量不溶物，经测试不影响后续检测效果。
4. 本产品仅供科学研究使用，不得用于临床医学诊断及其他非合理用途。
