本产品适合于从≤5×106 个培养细胞、≤20mg 动物软组织(肝脏、脾脏、肾脏，脑等)、≤100mg 植物/真菌组织样品中提取总 RNA。试剂盒基于硅胶柱纯化技术，提取过程中无需使用有毒的酚氯仿抽提，整个提取过程只需10~15分钟。得到的RNA可直接用于RT-PCR、Northern Blot、Poly A 纯化，核酸保护和体外翻译等实验。
产品信息
| 产品名称 | 货号 | 规格 |
| RNA快速提取试剂盒-单柱法 | HSM010111-01 | 24T |
| HSM010111-02 | 100T |
产品组分
| 组分 | HSM010111-01 | HSM010111-02 | 主要组分 | 组分功能 |
| 纯化次数 | 24次 | 100次 | / | / |
| 纯化柱 B10 | 24个 | 100个 | 玻璃纤维滤膜 | 吸附核酸 |
| 2mL Collection Tubes | 24个 | 100个 | 塑料管 | 收集滤液 |
| RTL Lysis Buffer | 16mL | 60mL | 异硫氰酸胍/EDTA | RNA裂解液 |
| Buffer RW1 | 15mL | 60mL | 异硫氰酸胍/乙醇 | 洗涤除蛋白 |
| Buffer RW2 | 12mL | 50mL | Tris/NaCl | 洗涤除盐离子 |
| RNase Free Water | 10mL | 20mL | DEPC处理水 | 洗脱液 |
准备事项
1. (可选)提升裂解液的变性能力：使用前按1mL RTL Lysis Buffer 加入 20µL 2-巯基乙醇或 1M DTT，混合液室温可保存 1 周。2-巯基乙醇/DTT 能打断 RNase 分子间的二硫键，高效灭活 RNase，提高 RNA 质量。大部分的细胞样品无需添加疏基乙醇或 DTT。
2. 按瓶子标签所示，加入 4 倍体积的无水乙醇稀释 BufferRW2，于室温保存
实验流程
A. 培养细胞实验步骤
本产品单次处理不超过 5×106 个培养细胞。初次使用时建议使用 2~5×106 个培养细胞，根据结果再调整细胞量，但不论何种情况，细胞用量都不要超过 1×107。
1. 样品裂解：加入适量的 RTL Lysis Buffer至细胞样品中，涡旋或吸打裂解细胞。
（1）悬浮培养细胞(不超过 5×106 )：计算细胞数量，取适量培养液至离心管中，300×g离心 5 分钟收集细胞，倒弃培养液。短暂离心吸弃所有残液。弹打或涡旋松散细胞沉淀，然后加入 500µL RTL Lysis Buffer，涡旋打散细胞。
（2）贴壁细胞直接裂解(不超过 5×106 )：彻底吸弃培养液，向培养瓶或培养皿中加入550µL RTL Lysis Buffer，用细胞刮棒收集裂解液，然后用移液器转移 500µL 裂解液转移至 1.5mL 离心管中，涡旋打散明显细胞团。
（3）贴壁细胞胰酶处理(不超过 5×106 )：吸弃培养液，用 PBS 清洗细胞，用含 0.1-0.25%含胰蛋白酶的 PBS 处理细胞，当细胞完全悬浮后，加入含血清的培养液灭活胰蛋白酶，按悬浮培养细胞进行操作。
2. 样品匀浆：用移液枪或 1mL 注射器抽打裂解液 5 次打断 DNA。
（1）若细胞数量小于 10 5 时，涡旋 1 分钟匀浆样品。
（2）细胞数量小于 2×106 时，用移液器吸打5-10 次匀浆样品。
（3）数量超过 2×106 时，用移液器或最好用1mL 注射器反复抽打 5 次以打断 DNA，降解粘度，减少 DNA 污染。
3. 调节结合条件：加入 0.8 倍体积 BufferRW2 至裂解液中，涡旋混匀 10 秒或移液枪吸打 5~10 次。若加入 BufferRW2 后产生明显沉淀时，用移液枪反复吸打几次打散沉淀。第 4 步操作时要连同沉淀一起转移至纯化柱中。
4. 过柱吸附：把纯化柱 B10 装在收集管中，把全部混合液转移至柱子中。12,000×g 离心1 分钟。
5. 除蛋白：倒弃滤液把柱子装回收集管。加入 500µL Buffer RW1，12,000×g 离心 1 分钟。
6. 脱盐：倒弃滤液把柱子装回收集管。加入500µL BufferRW2，12,000×g 离心 1 分钟。
7. 脱盐：倒弃滤液把柱子装回收集管。加入500µL BufferRW2，12,000×g 离心 1 分钟。
8. 干燥：倒弃滤液把柱子装回收集管。12,000×g 离心 2 分钟甩干柱子。
9. 洗脱：将柱子转移至 1.5mL 离心管，加入30~100µL RNaseFreeWater 至柱子膜中央。室温静置 2 分钟。12,000×g 离心 1 分钟。弃去柱子，把 RNA 保存于-80℃。
B. 组织实验步骤
本产品一次可处理 1~20mg 动物软组织和30~100mg 植物组织。正确组织量是获得理想产量和纯度关键。建议肝脏用 10-15mg,脾脏或胸胰富含 DNA 用量 5~10mg，其它动物组织为 10-20mg，简易的植物或真菌组织30~100mg。初次使用时，推荐起始动物组织量为 10mg，植物用量为 50mg。皮肤、肌肉或 富 含 肌 纤 维 的 组 织 样 品 建 议 使 用HSM010121。初次使用时，推荐起始动物组织量为 10mg，植物用量为 50mg。
1. 样品裂解和匀浆：根据样品类型和实验室情况，对样品进行匀浆。
（1）液氮研磨：取适量的动物组织或植物组织至研钵中，加入液氮反复研磨直至把样品研磨成细小的粉末，然后转移 5-20mg 动物组织粉末或 30-100mg 植物组织粉末至 1.5mL 离心管中，立即加入 550µL RTL Lysis Buffer，涡旋混匀 10~15 秒打散样品。若样品粘稠无法分散时，用移液枪反复吸打几次。处理脾脏/肝脏等富含 DNA 的动物组织时，最好再用1mL 注射器抽打 5 次打断 DNA 降低粘度，减少 DNA 污染。
（2）电动/玻璃匀浆器匀浆：取 1-20mg 动物组织或 30-100mg 植物粉末至匀浆器，加入550µL RTL Lysis Buffer 至样品中，立即用电动匀浆器或玻璃匀浆器将样品匀浆成均一的悬浮液，然后转移全部匀浆器至 1.5mL 离心管中。
2. 室温下，14,000×g 离心 5 分钟，转移500µL 上清液至新的离心管中。
3. 调节结合条件：加入 0.8 倍体积 BufferRW2 至上清液中，涡旋混匀 10 秒。若加入 BufferRW2 后产生明显沉淀时，用移液枪反复吸打几次让沉淀尽量分散。第 4 步操作时转移溶液上柱子时，要连同沉淀一起转移。
4. 过柱吸附：把纯化柱 B10 装在收集管中，把全部混合液转移至柱子中。12,000×g 离心1 分钟。
5. 除蛋白：倒弃滤液把柱子装回收集管。加入 500µL Buffer RW1，12,000×g 离心 1 分钟。
6. 脱盐：倒弃滤液把柱子装回收集管。加入500µL BufferRW2，12,000×g 离心 1 分钟。
7. 脱盐：倒弃滤液把柱子装回收集管。加入500µL BufferRW2，12,000×g 离心 1 分钟。
8. 干燥：倒弃滤液把柱子装回收集管。12,000×g 离心 2 分钟甩干柱子。
9. 洗脱：将柱子转移至 1.5mL 离心管，加入30~100µL RNaseFreeWater 至柱子膜中央。室温静置 2 分钟。12,000×g 离心 1 分钟。弃去柱子，把 RNA 保存于-80ºC。
常见问题
1. 柱子堵塞
（1）样品用量太多：减少样品量，超量的组织或细胞反而会降低产量和纯度。
（2）样品富含肌纤维：肌肉、心脏、皮肤以及一些低等小型生物含肌纤维，肌纤维分子量太大会引起柱子堵塞。
（3）样品富含脂类物质：脑，脂肪富含脂类物质。
（4）富含多糖类样品：富含多糖的组织。
（5）裂解液离心不充分：组织裂解液需高速离心去除杂质。细胞碎片会引起柱子的堵塞。处理某些样品时，离心后裂解液表面还可能会有一层脂类层，转移上清液尽量不要吸到这些物质。
2. RNA 降解
（1）样品贮藏问题：反复解冻会引起 RNA 降解，确保样品解冻次数不要超过 2 次。
（2）裂解问题：样品在解冻前，需要在 RTLLysisBuffer 中快速匀浆。样品只能充分裂解后，内源的核酸酶才能被灭活，RNA 才不会降解。
（3）电泳原因：常见的 RNA 降解现象都是电泳过程中引起的，更换新的 Loading Buffer和电泳缓冲液。
3. DNA 的污染DNaseI 消化：若纯化的 RNA 用于 RT-PCR，建议在上清液或裂解液中添加 DNase I 进行DNA 去除。
4. RNA 产量低
（1）洗脱不充分：RNaseFree Water 需直接加到膜上，并静置几分钟后再离心，进行第二步洗脱以提高产量。
（2）样品用量太多：减少样品用量，超量的样品有时会引起产量下降。
5. OD260/230 低于 1.0
（1）当 RNA 总量高于 10ug 时，OD260/230一般都在 1.0-2.2；
（2）当 RNA 总量在 5~10ug 时，A260/230会在 0.7~2.0；
（3）当 RNA 总量低于 3ug，A260/230 会低于 0.6。这是因为 RTL Lysis Buffer 和 Buffer RW1 含异硫氰酸胍，以及玻璃滤膜有吸水性或本底吸附。异硫氰酸胍在 230nm 有强烈吸光值，因此 A260/230 主要受该胍盐影响，而不是来源于样品。研发表明，低浓度异硫氰酸胍不影响反转录，定量 RT-PCR，二代测序等相关应用。出现 260/230 在 0.2-1.0 时，可以忽略并直接用于反转录等下游应用。在不堵塞柱子的情况下，适量提高样品用量和裂解液用量，提高核酸浓度（核酸总量>10ug)时，OD260/230 可以明显改善。
注意事项
本产品仅限于科学实验研究使用，不得用于临床诊断、治疗等领域。
