本产品适合于从各种生物样品中提取高纯度总 RNA。试剂盒将一步法的 RNA 抽提技术和柱法纯化技术相结合，可最大程度上提高RNA纯度和样品的适应性。HzyZoLReagent 含异硫氰酸胍和酸性酚，可快速裂解生物样品和灭活核酸酶，保护 RNA 不降解。经过 BufferBCP抽提后形成三相结构，其中 RNA 分布于水相层，DNA 和蛋白质分布于中间层和有机层，达到分离 RNA 的目的。纯化的 RNA 可直接用于 RT-PCR、Northern 杂交、Poly(A)富集、二代测序等下游应用。
产品信息
| 产品名称 | 货号 | 规格 |
| 高纯RNA提取试剂盒-TrizoL前处理结合柱法 | HSM010121-01 | 24T |
| HSM010121-02 | 100T |
产品组分
| 组分 | HSM010121-01 | HSM010121-02 | 主要组分 | 组分功能 |
| 纯化次数 | 24次 | 100次 | / | / |
| 纯化柱 B10 | 24个 | 100个 | 玻璃纤维滤膜 | 吸附核酸 |
| 2mL收集管 | 24个 | 100个 | 塑料管 | 收集滤液 |
| HzyZoL Reagent | 27mL | 110mL | 酸性酚、异硫氰酸胍 | RNA提取试剂 |
| Buffer BCP | 3mL | 15mL | 溴氯丙烷（低毒） | 代替氯仿 |
| Buffer RW2 | 6mL | 25mL | Tris/NaCl | 洗涤除盐离子 |
| RNase Free Water | 10mL | 20mL | DEPC处理水 | 洗脱液 |
保存条件
本产品可在室温保存 18 个月。收到产品后或平时使用时，建议把 HzyZoL Reagent 保存于2-8℃，以确定样品在匀浆时处于较低温度的状态。
准备事项
按瓶子标签所示，加入 4 倍体积的无水乙醇稀释 BufferRW2，于室温保存。
实验流程
A. 样品的裂解
1. 样品裂解和匀浆：按下列方法对样品进行匀浆和裂解。生物样品经 HzyZoL Reagent匀浆后可以长期保存于-20℃，淋巴细胞或培养细胞匀浆后可以在 2-8℃保存一周。
（1）动 物 组 织 （不 超 过 100mg）： 取10-100mg 动物组织，加入 1mL HzyZoLReagent，立即用研磨杵、玻璃匀浆器、电动研磨棒器或电动匀浆器进行充分匀浆。难裂解组织（如骨头，软骨，皮肤）用液氮研磨处理(参照植物处理方法)。
（2）植物组织（不超过 100mg）：用液氮将组织样品磨成粉末状，称取 50-100mg 样品至离心管中，立即加入 1mL HzyZoL Reagent，立即涡旋充分打散样品。易研磨水果或幼嫩植物组织可以无需液氮研磨，按动物组织进行操作。
（3）贴壁细胞（不超过 1×107）：彻底去除培养液，加入 1mL HzyZoL Reagent，移液枪吸打 3-5 次，让细胞充分裂解。
（4）悬浮细胞（不超过 1×107）：500×g离心收集细胞去除培养液。涡旋或用手指弹打松散细胞团。加入 1mL HzyZoL Reagent，涡旋让细胞充分裂解。
（5）细菌（不超过 1×109）：取适量处理指数生长期的培养液离心收集)至离心管中，于10,000×g 离心 1 分钟收集细菌，小心吸弃全部培养液。加入 1mL HzyZoL Reagent 和
0.3~0.5g酸性玻璃粉，涡旋10 分钟裂解细菌。
（6）酵母或单细胞真菌（不超过 1×107）：取适量酵母或真菌培养液收集至离心管中，于5,000×g 离心 10 分钟收集真菌，小心吸弃全部培养液。加入 1mL HzyZoL Reagent 和
0.3~0.5g 酸性玻璃珠，涡旋 10 分钟裂解。
（7）液体样品（不超过 100µL）：取不超过100µL 细胞重悬液、匀浆液、血液黄层、骨髓、抗凝血液或体液等液体样品到 1.5mL 离心管中，加入 1mL HzyZoL Reagent 立即涡旋混匀让细胞裂解，或样品粘稠时可以用移液器反复吸打几次。
2. 室温放置 3~5 分钟。
3. 去除油脂：(可选) 4℃，12,000×g 离心 10分钟。转移上清液至新的离心管中。处理富含蛋白质或难裂解的组织样本时，匀浆后仍可能存不溶解的物质。离心去除这些杂质有利于提高纯度。富含脂肪的样本，离心后还会在溶液表面存在一层油脂层，转移上清液时尽量不要吸取到油脂。
4. 萃 取： 按 1mL HzyZoL Reagent 加 入100µL Buffer BCP（或 200µL 氯仿）至裂解液中。用手快速翻转或剧烈上下来回振荡 15秒，室温放置 3 分钟。4℃，12,000×g 离心15 分钟。用涡旋取代振荡会带来更多的基因组 DNA 污染。振荡必须快速的，缓慢颠倒会造成抽提不充分，氯仿须按比例加入，过多的氯仿会逼使DNA 和蛋白质回到水相中，导致 RNA 的纯度下降。离心后会形成三相体系。上层为水相层含有RNA，而DNA和蛋白质位于有机层(下层)和中间层。中间层的多少取决于样本类型，有些样品的中间层较少。建议只转移 80%的上清液，以减少 DNA 污染。
B. 过柱纯化
1. 调节结合条件：转移 500µL 上清液至新的离心管中，加入 250µL 无水乙醇，涡旋混匀10 秒。若需要得到小分子 miRNA，加入 1.5 倍无水乙醇。
2. 过柱吸附：把纯化柱 B10 装在 2mL 收集管中。转移≤750µL 混合液至柱子中。12,000×g 离心 30~60 秒。倒弃滤液，把柱子装回收集管。转移剩余混合液至柱子。12,000×g 离心 30~60 秒。
3. 脱盐：倒弃滤液，把柱子装回收集管。加入 750µL Buffer RW2 至柱子中，12,000×g离心 30~60 秒。当核酸浓度较低时（<100ng/µL)，建议把Buffer RW2 分成两次清洗，每次用 500µL，可以稳定 A260/230 比值。
4. 干燥：倒弃滤液，把柱子装回收集管。12,000×g 离心 1 分钟。
5. 洗脱：将柱子转移至 1.5mL 离心管，加入30~100µL RNaseFreeWater 至柱子膜中央。室温静置 2 分钟。12,000×g 离心 1 分钟。
6. 弃去柱子，把 RNA 保存于-80℃。
RNA 完整性和纯度检测
完整性检测：用 0.5×TBE 电泳缓冲液配制
1.2%琼指糖凝胶，RNA 上样量为 0.5~1.5µg，150V 电泳 15 分钟。电泳图上能看两条明显的rRNA 条带，其中 28S rRNA 的亮度好明显亮于 18SrRNA，表明 RNA 条带完整不降解。纯度 1：OD260/280 比值衡量蛋白质污染程度的指标。高纯度 RNA 的 OD260/280 比值为
2.0。由于 OD260，OD280，OD230 会受 pH值影响。本产品采用 RNaseFree Water 溶解，其 pH 波动比较大（5.5~7.5），OD260/280比值在 1.8-2.1 之间是合理的。若需要获得更佳比值，建议取 2µL RNA 加入 2-4µL ElutionBuffer(10mm Tris, pH8.0)混匀后再测。纯度 2：当 RNA 总量高于 7ug 时，OD260/230一般都在 1.5-2.2；当 RNA 总量低于 3ug，A260/230 会低于 0.6。这是因为 HzyZoLReagent 含异硫氰酸胍，以及玻璃滤膜有吸水性或本底吸附。异硫氰酸胍在 230nm 有强烈吸光值，因此 A260/230 主要受该胍盐影响，而不是来源于样品。研发表明，低浓度异硫氰酸胍不影响反转录，定量 RT-PCR，二代测序等相关应用。出现 260/230 在 0.2-1.0 时，可以忽略并直接用于反转录等下游应用。在不堵塞柱子的情况下，适量提高样品用量和裂解液用量，提高核酸浓度（核酸总量>10ug)时，OD260/230 可以明显改善。
控制环境中 RNase 的污染
1. 经常更换手套，因为皮肤和物品表面带有细菌可能导致 RNase 污染。使用无 RNase 离心管和枪头等塑料制品避免污染。
2. 研磨棒、研钵、玻璃匀浆器，剪刀等器具于 150℃烘烤 4 小时去除 RNase 污染。
3. 塑料器具可以 0.5M NaOH 浸泡 10 分钟，然后用超纯水清洗干净灭菌后使用。
4. 生物样品在 HzyZoL Reagent 中尽快匀浆打散，充分匀浆后，样品中内源性 RNase 可能被灭活。
注意事项
本产品仅限于科学实验研究使用，不得用于临床诊断、治疗等领域。
