本产品适合于从≤1×107 个培养细胞、≤1×109 个细菌、≤20mg 动物软组织(肝脏、脾脏、肾脏，脑等)、≤50mg 肌纤维组织、≤100mg植物/真菌样品中提取总 RNA。试剂盒基于硅胶柱纯化技术，提取过程中无需使用有毒的酚氯仿抽提，整个提取过程只需 20~25 分钟。试剂盒结合 DNA 过滤技术，可高效地过滤去除 DNA。得到的 RNA 可直接用于 RT-PCR、Northern Blot、Poly A 纯化，核酸保护和体外翻译等实验。
产品信息
| 产品名称 | 货号 | 规格 |
| 安全型RNA提取试剂盒-双柱，无酚氯仿/巯基乙醇 | HSM010131-01 | 24T |
| HSM010131-02 | 100T |
保存条件
本产品可在室温保存 18 个月。低温下，BufferRLC 可能会有沉淀形成，55℃水浴让沉淀完全溶解。
产品组分
| 组分 | HSM010131-01 | HSM010131-02 | 主要组分 | 组分功能 |
| 纯化次数 | 24 | 100 | / | / |
| 纯化柱 B10 | 48 | 2×100 | 玻璃纤维滤膜 | 吸附核酸 |
| 2mL收集管 | 48 | 2×100 | 塑料管 | 收集滤液 |
| Buffer RLC | 15mL | 70mL | 异硫氰酸胍/Triton X-100 | RNA裂解液 |
| Buffer RW1 | 15mL | 60mL | 异硫氰酸胍/乙醇 | 洗涤除蛋白 |
| Buffer RW2 | 12mL | 50mL | Tris/NaCl | 洗涤除盐离子 |
| RNase Free Water | 10mL | 20mL | DEPC处理水 | 洗脱液 |
准备事项
1. 减少裂解时气泡产生: Buffer RLC 含表面活性剂，匀浆时会产生泡沫而给操作带来麻烦。按 1mL BufferRLC 加入 5µL ReagentDX（消泡剂）可以起到良好消泡效果。BufferRLC/DX混合液可以长期放置，使用前颠倒混匀后再使用。
2. 加入 DTT 或 2-疏基乙醇提高 RNA 完整性:处理大部分细胞、植物、组织时，DTT 或 2-巯基乙醇无需添加。若下游应用有要求或样品富含核酸酶时，按 1mL BufferRLC 加入 20µL2-巯基乙醇或1M DTT可以提高核酸酶灭活效果。Buffer RLC/DTT 或 Buffer RLC/巯基乙醇可以在 2-8℃保存 1 个月。
3. 提高 RNA 产量：处理低 RNA 的植物或真菌类样品，初次实验(50-100mg）成功后，可根据需求提高样品用量来提高产量。实验表明，800µLBufferRLC已成功处理300mg玉米叶片，水稻叶片的 RNA 提取，产量超过 60ug。受 DNA 过滤柱的载量影响，动物组织或富含DNA 的样品，需要控制样品量，以免产生更多的 DNA 污染。
4. 按瓶子标签所示加入 4 倍体积的无水乙醇稀释 BufferRW2，室温保存
实验流程
1. 样品的匀浆和裂解：根据样品类型和用量，按下述方法对样品处理匀浆和裂解。样品裂解和匀浆后，可直接保存于-20℃。
（1）悬浮细胞（不超过 1×107）：估算细胞数量，转移适量培养液至离心管中，300×g离心 5 分钟收集细胞，小心吸弃培养液，余下不超过 20µL 残液和细胞沉淀。用手指弹打或涡旋松散细胞，加入 600µL BufferRLC，涡旋或用移液器吸打 3-5 次混匀待用。
（2）贴壁细胞（直接裂解，1×107）：彻底吸弃培养液，向培养皿/瓶（容器直径不超过10cm)，直接加入 600µL BufferRLC，用细胞刮棒收集裂解液。
（3）贴壁细胞（胰酶，不超过 1×107）：估算细胞数量，吸弃培养液，用 PBS 洗涤细胞，吸除 PBS，向细胞中加入含有 0.1-0.25%胰蛋白酶的 PBS 处理细胞，当细胞完全脱落后，加入含血清培养基失活胰蛋白酶，将细胞转移至离心管中，300×g 离心 5 分钟收集细胞，小心吸附培养液，余下不超过 20µL 残液和细胞沉。用手指弹打或涡旋松散细胞，加入600µL BufferRLC，涡旋或用移液器吸打 3-5次混匀待用。
（4）细菌（不超过 1×109）：取适量处于指数期细菌培养液至 1.5mL 离心管中，于10,000×g 离心 1 分钟收集细胞，小心吸弃所有培养液。加入100ul TE/Lysozme重悬细胞，室温放置 15 分钟。加入 500µL BufferRLC，涡旋混匀。
（5）全血：取不超过 1-1.5mL 新鲜或冻存血液，用红细胞裂解液分离出淋巴细胞。用手指弹打或涡旋松散淋巴细胞，加入 600µL BufferRLC，涡旋或用移液器吸打 3-5 次待用。
（6）动物软组织（脾脏不超过 10mg）：取不超过 20mg 肝脏、肾脏、脑等组织，加入600µL BufferRLC，用玻璃匀浆器、电动研磨棒或电动匀浆器进行充分匀浆待用。
（7）动物肌纤维组织：取 30~50mg 肌肉、皮肤、心脏、肠组织等样品，加入 500µL BufferRLC，用玻璃匀浆器或电动匀浆器进行充分匀浆。加入 200µL RNase Free Water 和 10µLProteinaseK，室温放置 15 分钟。14,000×g离心 5 分钟得上清待用。
（8）植物样品（100mg）：用液氮将植物或真菌样品研磨成粉末，取 50-100mg 粉末至
1.5mL 离心管中，加入 600ul BufferRLC，立即涡旋打散样品。14,000×g 离心 5 分钟得上清待用。
2. 去除 DNA：把纯化柱 B10 装在 2mL 收集管中。把上述裂解液或离心后的上清液转移至纯化柱 B10 中，14,000×g 离心 2 分钟。
3. 调整 RNA 结合条件：弃去纯化柱 B10。加入0.8倍滤液体积的BufferRW2至收集管中，用移液枪吸打 3~5 次。处理肝脏和脾脏时，加入 0.5倍的 BufferRW2有利于提高产量。若需要得到 DNA，保留第一个柱子，加入 Buffer RW2 进行清洗，最后用 BufferTE 洗脱出 DNA，得到的 DNA 可用PCR 等相关应用。
4. 吸附 RNA：取新的纯化柱 B10 装在收集管中，转移一半体积的混合液至柱子中。12,000×g 离心 1 分钟。
5. 倒弃滤液，把柱子再装回收集管中。转移余下混合液至柱子再离心。
6. 除蛋白质：倒弃滤液，把柱子装回收集管。加入 500µL BufferRW1 至柱子上。12,000×g 离心 1 分钟。
7. 脱盐：倒弃滤液，把柱子装回收集管。加入 500µL Buffer RW2 至柱子中，12,000×g离心 30~60 秒。
8. 脱盐：倒弃滤液，把柱子装回收集管。加入 500µL Buffer RW2 至柱子中，12,000×g离心 30~60 秒。
9. 干燥：倒弃流出液，把柱子装回收集管。12,000×g 离心 2 分钟。
10. 洗脱：将柱子转移至 1.5mL 离心管，加入 30-100µL RNase Free Water 至柱子膜中央。室温静置 2 分钟。12,000×g 离心 1 分钟。弃去柱子，把 RNA 保存于-80ºC。
RNA 完整性和纯度检测
完整性检测：用 0.5×TBE 电泳缓冲液配制
1.2%琼指糖凝胶，RNA 上样量为 0.5~1.5µg，150V 电泳 15 分钟。电泳图上能看两条明显的rRNA 条带，其中 28S rRNA 的亮度好明显亮于 18SrRNA，表明 RNA 条带完整不降解。纯度 1：OD260/280 比值衡量蛋白质污染程度的指标。高纯度 RNA 的 OD260/280 比值为
2.0，但由于 OD260，OD280，OD230 会受到pH 值的影响。本产品采用 RNase FreeWater溶解（DEPC 处理水），其 pH5.5-7.5 波动，OD260/280 比值为 1.9-2.1。纯度2:当RNA总量高于10ug时，OD260/230一般都在 1.3-2.2；当 RNA 总量在 5~10ug 时，A260/230会在0.7~2.0；当RNA总量低于3ug，A260/230 会低于 0.6。这是因为 Buffer RLC和 BufferRW1 含异硫氰酸胍，以及玻璃滤膜有吸水性或本底吸附。异硫氰酸胍在 230nm有强烈吸光值，因此 A260/230 主要受该胍盐影响，而不是来源于样品。研发表明，低浓度异硫氰酸胍不影响反转录，定量 RT-PCR，二代测序等相关应用。出现 260/230 在 0.2-1.0时，可以忽略并直接用于反转录等下游应用。在不堵塞柱子的情况下，适量提高样品用量和裂解液用量，提高核酸浓度（核酸总量>10ug)时，OD260/230 可以明显改善。
控制环境中 RNase 的污染
1. 经常更换手套，因为皮肤和物品表面带有细菌可能导致 RNase 污染。使用无 RNase 离心管和枪头等塑料制品避免污染。
2. 研磨棒、研钵、玻璃匀浆器，剪刀等器具于 150℃烘烤 4 小时去除 RNase 污染。
3. 塑料器具可以 0.5M NaOH 浸泡 10 分钟，然后用超纯水清洗干净灭菌后使用。
4. 生物样品在 RLC 中尽快匀浆打散，充分匀浆后，样品中内源性 RNase 可能被灭活。
注意事项
本产品仅限于科学实验研究使用，不得用于临床诊断、治疗等领域。
