将改良的胍盐提取方法和柱法纯化技术结合起来，适合于从各种植物/真菌样品，特别是富含多糖多酚的植物组织（如棉花叶片、成熟水稻叶片、拟南芥种子，白松松针，枇杷叶片，月季等）中提取高纯度的 RNA。得到的 RNA可直接用于 RT-PCR、Northern Blot、polyA +纯化、核酸保护和体外翻译等实验。
产品信息
| 产品名称 | 货号 | 规格 |
| 通用植物RNA试剂盒-常规和多糖多酚类植物 | HSM010141-01 | 24T |
| HSM010141-02 | 100T |
产品组分
| 组分 | HSM010141-01 | HSM010141-02 | 主要组分 | 组分功能 |
| 纯化次数 | 24 | 100 | / | / |
| 纯化柱 B10 | 48 | 2×100个 | 玻璃纤维滤膜 | 吸附核酸 |
| 2mL收集管 | 48 | 2×100个 | 塑料管 | 收集滤液 |
| Buffer RLF | 20mL | 80mL | 胍/Triton X-100 | RNA裂解液 |
| Buffer PAL | 20mL | 80mL | CTAB/NaCl/Tris | RNA裂解液 |
| Buffer RW1 | 15mL | 60mL | 异硫氰酸胍/乙醇 | 洗涤除蛋白 |
| Buffer RW2 | 6mL | 25mL | Tris/NaCl/乙醇 | 洗涤除盐离子 |
| RNase Free Water | 10mL | 20mL | DEPC处理水 | 洗脱液 |
准备事项
按瓶子标签所示，加入 4 倍体积的无水乙醇稀释 BufferRW2，室温保存。
实验流程
A.多糖多酚类
1. 样品研磨：用液氮将植物或真菌研磨成粉末，称取 50-100mg 粉末至 2.0mL 离心管中。立即加入 0.7mL Buffer RLF 至样品中，立即涡旋 10~15 秒让样品充分分散。
（1）使用前按1mL BufferRLF加入50µL 2--巯基乙醇，混合液室温可以保存 1 周。由于巯基乙醇气味很重，可用无气味的还原剂 TCEP代替。
（2）研磨好的样品在称量、转移、存放或加入 RLF 之前都不能解冻，否则 RNA 会降解。加入 Buffer RLF 后要立即涡旋 10-15 秒让样品充分分散，成团样品用移液器吸打辅助分散，然后再进行第二个样品研磨操作。
（3）处理易研磨植物样品(水果果实/鲜嫩叶片等)，直接转移 50~100mg 样品和 0.8mLBufferRLF 至研钵中研磨或电动匀浆器研磨，然后转移 0.7mL 匀浆液至离心管中，按第二步进行操作。
（4）受植物样品多样性影响，且生不同生长发育阶段组织 RNA 含量差异显著，初次实验时，常规植物或多酚类样品用 50mg，富含粘液质的组织样品用 30mg 进行提取,根据实验结果调整样品用量，但最高不建议超过100mg。
（5）淀粉类样品：如水稻种子、根块富含淀粉的样品，BufferRLF 会引起淀粉糊化造成裂解液粘稠固化。处理这种样品时，使用方案 B。
（6）失败样品：由于植物中代谢物质含量差异很大，本方案虽然解决大部分的样品部分，但本产品未能解决问题，请尝试使用方案 B。方案 B 采用经典的 CTAB 裂解液，提供了另一种解决方案。
2. 室温下，13,000×g 离心 3 分钟。
3. 去除 DNA：把纯化柱 B10 装在收集管中。转移 0.6mL 上清液至纯化柱 B10 中，13,000×g 离心 1 分钟。
4. 调整 RNA 结合条件：弃去纯化柱 B10(含DNA）。加入 0.4 倍无水乙醇(~240µL)至滤液管中，涡旋混匀10秒或用移液枪吸打3~5次。
5. 吸附 RNA：取新的纯化柱 B10 装在收集管中，转移全部混合液至柱子中。13,000×g 离心 1 分钟。若出现堵柱现象，离心速度调至 14000-16000×g 并延长离心时间直至全部溶液滤出。
6. 除蛋白质：倒弃滤液，把柱子装回收集管。加入 500µL BufferRW1 至柱子上。13,000×g 离心 1 分钟。
7. 脱盐：倒弃滤液，把柱子装回收集管。加入 500µL Buffer RW2 至柱子中，13,000×g离心 1 分钟。
8. 脱盐：倒弃滤液，把柱子装回收集管。加入 500µL Buffer RW2 至柱子中，13,000×g离心 1 分钟。
9. 干燥：倒弃流出液，把柱子装回收集管。13,000×g 离心 2 分钟。
10. 洗脱：将柱子转移至 1.5mL 离心管，加入 30-100µL RNase Free Water 至柱子膜中央。室温静置 2 分钟。13,000×g 离心 1 分钟。弃去柱子，把 RNA 保存于-80℃。洗脱液体积不应少于 30µL，体积过小影响洗脱效率。如 RNA 得率超过 30µg，可重复第10 步洗脱步骤，重复时可以用新的 RNaseFree Water 液或洗脱液进行第二次洗脱。
B.（淀粉类，或疑难样品）
1. 裂解样品：用液氮将植物或真菌磨成粉末，称取 50~100mg 粉末至 2.0mL 离心管中，加入 0.7mL Buffer PAL 至样品中，立即剧烈涡旋充分打散样品，65ºC 放置 5~10 分钟。
•处理易研磨的植物样品(水果果实/鲜嫩叶片等)，转移 100~150mg 样品至研钵中，加入 1.0mL Buffer PAL/2-巯基乙醇至研钵中，立即进行充分的研磨，然后转移 0.8mL 匀浆液至 2.0mL 离心管中，65ºC 放置 5~10 分钟，按第 2 步进行操作。
•Buffer PAL 使用前，加入 2-巯基乙醇至1%(V/V),难提取样品可以提高至 5%。粘稠样品可以适当增加 BufferPAL 用量。
2. 除杂：加入 0.7mL 氯仿，涡旋混匀 15 秒，室温下，13,000×g 离心 5 分钟。油脂和蛋白质类种子类样品用酚氯仿代替氯仿抽提效果更好。
3. 调结合条件：转移 0.5mL 上清液至离心管中，加入 0.5 倍无水乙醇，涡旋混匀 10 秒。若这一步出现明显絮状沉淀，用移液器吸打数次打散沉淀。
4. 吸附总核酸：把纯化柱 B10 装在收集管中。转移混合液(含沉淀)至纯化柱 B10 中，13,000×g 离心 1 分钟。
5. 洗出 RNA：倒弃滤液，把柱子装在新的收集管中，加入 500µL Buffer RLF 至柱子中，静置 1~3 分钟，13,000×g 离心 1 分钟。
6. 调节结合条件：弃去纯化柱 B10，加入250µL 无水乙醇至滤液，吸打混匀 3-5 次。
7. 吸附 RNA：取新纯化柱 B10 装在旧收集管中，转移全部混合液至柱子中。13,000×g 离心 1 分钟。
8. 脱盐：倒弃滤液把柱子装回收集管，加入500µL BufferRW2 至柱子，13,000×g 离心 1分钟。
9. 脱盐：倒弃滤液把柱子装回收集管，加入500µL BufferRW2 至柱子，13,000×g 离心 1分钟。
10. 干燥：倒弃流出液，把柱子装回收集管。13,000×g 离心 2 分钟。
11. 洗脱：将柱子转移至 1.5mL 离心管，加入 30-100µL RNase Free Water 至柱子膜中央。室温静置 2 分钟。13,000×g 离心 1 分钟。弃去柱子，把 RNA 保存于-80ºC。洗脱液体积不应少于 30µL，体积过小影响洗脱效率。如 RNA 得率超过 30µg，可重复第11 步洗脱步骤，重复时可以用新的 RNaseFree Water 液或洗脱液进行第二次洗脱。
RNA 完整性和纯度检测
完整性检测：用 0.5×TBE 电泳缓冲液配制
1.2%琼指糖凝胶，RNA 上样量为 0.5~1.5µg，150V 电泳 15 分钟。电泳图上能看两条明显的rRNA 条带，其中 28S rRNA 的亮度好明显亮于 18SrRNA，表明 RNA 条带完整不降解。
1. 纯度 1：OD260/280 比值衡量蛋白质污染程度的指标。高纯度 RNA 的 OD260/280 比值为 2.0。由于 OD260，OD280，OD230 会受pH 值影响。本产品采用 RNase Free Water溶解（DEPC 处理水），其 pH5.5~7.5 波动，OD260/280 比值为 1.9-2.1。纯度2：当RNA总量高于10ug时，OD260/230一般都在 1.3-2.2；当 RNA 总量在 5~10ug 时，A260/230会在0.7~2.0；当RNA总量低于3ug，A260/230 会低于 0.6。这是因为 Buffer RLC和 BufferRW1 含异硫氰酸胍，以及玻璃滤膜有吸水性或本底吸附。异硫氰酸胍在 230nm有强烈吸光值，因此 A260/230 主要受该胍盐影响，而不是来源于样品。研发表明，低浓度异硫氰酸胍不影响反转录，定量 RT-PCR，二代测序等相关应用。出现 260/230 在 0.2-1.0时，可以忽略并直接用于反转录等下游应用。在不堵塞柱子的情况下，适量提高样品用量和裂解液用量，提高核酸浓度（核酸总量>10ug)时，OD260/230 可以明显改善。
注意事项
本产品仅限于科学实验研究使用，不得用于临床诊断、治疗等领域。
