SgrAI 来源于灰色链霉菌（Streptomyces griseus），经大肠杆菌重组表达后纯化获得， 特异性识别并切割 CR/CCGGYG 序列。SgrAI 可兼容 CutFlex 缓冲液，可用于和其他限制酶进行双酶切。基于酶的特殊性，SgrAI 需要两个及以上的酶切位点才能实现高效切割，对单位点的底物切割效率显著下降。
图标注释
最适反应温度为 37℃
对于被 CpG 甲基化的 DNA，剪切可能受阻
对于被 EcoKI 甲基化的 DNA，剪切可能受阻
对于被 EcoBI 甲基化的 DNA，剪切可能受阻
失活条件为 80℃温育 20 min
3 h 温育未表现星号活性，更长时间酶切可能出现星号活性
产品信息
| 产品名称 | 货号 | 包装规格 |
|---|---|---|
| SgrAI | HSM052071 | 500 U |
产品组分
| 组分 | 规格 |
|---|---|
| SgrAI(10 U/μL) | 50 μL |
| 10×CutBufferB | 1 mL |
运输及保存方法
-25~-15℃运输与保存。
建议反应条件
1. 1×Cut Buffer B； 2. 37℃温育； 3. 参照“DNA 酶切流程”配制反应体系。
失活条件
80℃温育 20 min。
活性定义
1 活性单位(U)是指在 50 μL 反应体系中，37℃ 1 h 内完全酶切 1 μg λDNA 所需的酶量。
质量控制
功能活性检测：37℃下，10 U SgrAI 能够在 15 min 内完全消化 1 μg λDNA。
超长时间温育检测：37℃下，将 10 U SgrAI 与 1 μg λDNA 共同温育 3 h，未检测到其他核酸酶污染或星号活性引起的底物非特异性降解。延时酶切可能出现星号活性。
酶切-连接-再酶切检测：37℃下，使用 10 U SgrAI 消化底物，回收酶切产物。在 22℃下使用适量 T4 DNA Ligase (Fast)可以将酶切产物重新连接。将连接产物再次回收后，使用相同的内切酶可以重新切开连接产物。
使用方法
1. DNA 酶切流程
1) 在冰上按如下建议的加样顺序配制反应体系
| 组分 | 体积 |
|---|---|
| ddH2O | up to 50 μL |
| 10×CutBufferB | 5 μL |
| 底物DNAa | 1 μg |
| SgrAI(10 U/μL) | 1 μL |
| Total | 50 μL |
a.DNA 底物中应不含苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、洗涤剂或高浓度盐，否则将会影响 SgrAI 酶活性；
2) 轻柔吸打或轻弹管壁以混匀（切勿涡旋）， 然后瞬时离心以收集挂壁液滴；
3) 37℃温育 15 min~1 h；
4) 80℃温育 20 min 即可使酶失活，停止反应, 或者通过吸附柱或苯酚/氯仿纯化终止反应。
注意事项
1) 酶切需要两个或两个以上识别位点。
2) 每μg DNA 底物使用的酶量不建议超过 10 U。
3) 因为反应中酶的稳定性，即使温育时间超过 1 h 也不会提高酶切效率，除非增加酶量。
4) 延长酶切时间、高浓度酶或>5%的甘油浓度可能产生星号活性，尤其不建议过夜酶切。
不同 DNA 中的酶切位点数量
| DNA | 酶切位点数量 |
|---|---|
| λDNA | 6 |
| ΦX174 | 0 |
| pBR322 | 1 |
| pUC57 | 0 |
| pUC18/19 | 0 |
| SV40 | 0 |
| M13mp18/19 | 0 |
| Adeno2 | 6 |
甲基化修饰影响
| Dam | Dcm | CpG | EcoKI | EcoBI |
|---|---|---|---|---|
| 无影响 | 无影响 | 剪切受影响 | 剪切受阻 | 剪切受阻 |
在不同反应缓冲液中的活性
| CutFlex Buffer | Thermo Scientific FastDigest Buffer | NEB rCutSmart™ Buffer | Takara QuickCut™ Buffer |
|---|---|---|---|
| 50% | ＜12.5% | 50% | ＜12.5% |
注：活性数据来自瀚海限制酶标准反应体系下的检测。
