T4 DNA连接酶由携带T4噬菌体gene 30的大肠杆菌产生。该酶催化双螺旋DNA或RNA之间的5′-磷酸基团和3′-羟基之间形成磷酸二酯键。该酶在双链DNA、RNA或者DNA/RNA复合物间可修复单链缺刻，并且可以连接有粘性末端或者平末端的DNA片段，但对于单链核酸无活性，主要用于限制性内切酶酶切产物DNA片段克隆、基因定点突变与PCR产物克隆、线性DNA自环化与修复双链DNA缺刻。T4 DNA连接酶需要ATP作为辅助因子，在室温下完成粘性末端连接反应仅需10 min。
产品信息
| 产品名称 | 货号 | 规格 |
| T4 DNA连接酶 | HSM060201 | 1000 U |
产品组分
| 组分 | 规格 |
| T4 DNA连接酶(5 U/μL) | 200 μL |
| 10× T4 DNA连接酶 Buffer | 2×1 mL |
| 50% PEG | 1 mL |
注: 1 U=1 Weiss unit
酶活单位定义
37℃条件下，1 Weiss unit的酶在20 min内催化1 nmol的[32PPi]转变为活性炭吸附态。1 Weiss unit等同于约200个粘性末端连接反应单位（CEU），相当于在16℃条件下，30 min内连接50% HindIII消化后的λDNA片段。
酶活检测条件
酶活在如下反应混合物中进行测试：66 mM Tris-HCl (pH 7.6)，6.6 mM MgCl2，66 μM ATP，10 mM DTT，3.3 μM [32PPi]。
质量控制
核酸内切酶残留检测：将5 U的T4 DNA连接酶与200 ng超螺旋质粒DNA在37℃下共同温育4 h后，使用琼脂糖凝胶电泳检测，少于10%的质粒DNA转变成缺刻或线性状态。
核酸外切酶残留检测：将5 U的T4 DNA连接酶与15 ng双链DNA片段在37℃温育16 h，使用琼脂糖凝胶电泳检测双链DNA底物无变化。
蓝白斑测试：室温条件下，使用5 U T4 DNA连接酶连接pUC57 DNA/HindIII、pUC57 DNA/PstI或pUC57 DNA/SmaI消化产物1 h，然后用E.coli XL1-Blue感受态细胞转化连接产物，检测到少于1%的白斑。
使用方法
1. DNA插入片段连接至载体DNA（粘性末端连接）
1) 于冰上配制如下反应体系：
| 试剂 | 使用量 |
| 线性化载体DNA | 20~100 ng |
| 插入片段DNA | 3:1~10:1（片段：载体摩尔比） |
| 10× T4 DNA Ligase Buffer | 2 μL |
| T4 DNA连接酶(5 U/μL) | 1 U |
| Nuclease-Free Water | up to 20 μL |
2) 充分混匀并瞬离，22℃温育10 min；
3) 取1~5 μL的连接产物用于50 μL化学感受态细胞的转化，或者取1~2 μL用于50 μL电转感受态细胞的转化。
注：如果连接反应产物用于电转化，应使用离心柱或者氯仿抽提清洁DNA代替热失活步骤。
2. DNA插入片段连接至载体DNA（平末端连接）
1) 于冰上配制如下反应体系：
| 试剂 | 使用量 |
| 线性化载体DNA | 20~100 ng |
| 插入片段DNA | 3:1~10:1（片段：载体摩尔比） |
| 10× T4 DNA连接酶 Buffer | 2 μL |
| 50% PEG | 2 μL |
| T4 DNA连接酶(5 U/μL) | 5 U |
| Nuclease-Free Water | up to 20 μL |
2) 充分混匀并瞬离，22℃温育1 h；
3) 取1~5 μL的连接产物用于50 μL化学感受态细胞的转化，或者取1~2 μL用于50 μL电转感受态细胞的转化。
注：如果连接反应产物用于电转化，应使用离心柱或者氯仿抽提清洁DNA代替热失活步骤。
3. 线性DNA自环化
1) 于冰上配制如下反应体系：
| 试剂 | 使用量 |
| 线性化DNA | 10~50 ng |
| 10× T4 DNA Ligase Buffer | 5 μL |
| T4 DNA连接酶(5 U/μL) | 5 U |
| Nuclease-Free Water | up to 50 μL |
2) 彻底混匀并瞬离，22℃温育10 min；
3) 取1~5 μL的连接产物用于50 μL化学感受态细胞的转化，或者取1~2 μL用于50 μL电转感受态细胞的转化。
注：如果连接反应产物用于电转化，应使用离心柱或者氯仿抽提清洁DNA代替热失活步骤。
4. 接头连接
双链寡核苷酸接头经常被用于在插入片段上产生粘性末端。接头通常包含限制酶识别位点，在连接后经酶切处理产生和克隆载体匹配的粘端。有时候接头已包含与克隆载体匹配的粘端，此时无需在接头连接完成后进行插入片段的进一步处理。
1) 于冰上配制如下反应体系：
| 试剂 | 使用量 |
| 线性化DNA | 100~500 ng |
| 磷酸化接头 | 1~2 μg |
| 10× T4 DNA Ligase Buffer | 2 μL |
| 50% PEG | 2 μL |
| T4 DNA Ligase (Fast) | 2 U |
| Nuclease-Free Water | Up to 20 μL |
2) 彻底混匀并瞬离，22℃温育10 min；
3) 在65℃作用10 min或者70℃作用5 min，进行热失活。
注1：添加1 mM ATP的条件下，T4 DNA Ligase(Fast)在CutFlex酶切缓冲液中具有100%的活力。因此，接头连接反应时可以在CutFlex酶切缓冲液中进行，以简化“接头连接-酶切”实验流程。具体方法为：向接头连接体系中添加ATP至浓度1 mM，接头连接反应完成后，先失活T4 DNA Ligase(Fast)。然后，再在体系中加入适量的内切酶，最后使用最适酶切反应温度进行温育即可。
注2：CutFlex酶切缓冲液中不含ATP组分，瀚海提供独立包装的ATP母液（货号：HBP0003205）。
注意事项
1. T4 DNA Ligase (Fast)在浓度高于200 mM的NaCl或KCl中会被强烈抑制；
2. 连接反应液添加量不应该超过感受态细胞体积的10%，不推荐体系中加入过量的T4 DNA Ligase (Fast)；
3. 与T4 DNA Ligase (Fast)结合的DNA可能会在琼脂糖凝胶中出现带移或弥散，为了避免此现象，可以在上样前对酶进行热失活，必要时加入适量的SDS；
4. 聚乙二醇(PEG)能极大地提高平末端连接的连接效率，PEG 8000的推荐添加量是连接体系的5%(w/v)；
5. 电转化效率可能通过对T4 DNA Ligase (Fast)热失活或者使用离心柱或者氯仿抽提纯化DNA方式来提高；
6. 转化子数目可通过延长反应时间至1 h而增加。
