T4 RNA Ligase 2，即 T4 RNA 连接酶 2，是一种 ATP 依赖的双链 RNA 连接酶（double-strand RNA ligase，dsRNA Ligase），也被称为 T4 Rnl2，可以用于双链 RNA 进行分子内的环化连接和分子间的线性连接。T4 RNA Ligase 2 与 T4 RNA Ligase 1 不同的是，对双链 RNA 中 nick 的连接活性要大大高于对单链 RNA 末端的连接活性。T4 RNA Ligase 2 也可用于双链核酸（RNA 双链、RNA/DNA 杂合链或 DNA 双链）分子内或分子间 RNA 链的 3′羟基和 DNA 链的 5′磷酸基的连接。T4 RNA Ligase 2 连接时需要 5′磷酸和 3′羟基的存在，可以使 RNA 链或 DNA 链的 5′磷酸基和 RNA 链的 3′羟基之间发生连接反应。主要用于连接双链 RNA 中缺刻的连接（即双链 RNA 的粘端连接），也可用于双链结构中，RNA 3′羟基与 DNA 5′磷酸基的缺刻连接。T4 RNA Ligase 2 为大肠杆菌表达的重组蛋白，表达基因的来源为 T4 噬菌体。
产品信息
| 产品名称 | 货号 | 规格 |
| T4 RNA 连接酶 2 | HBP001103 | 100 μL |
| HBP001104 | 500 μL | |
| HBP001107 | 50 mL | |
| HBP001108 | 100 mL |
产品组分
| 组分 | HBP001103 | HBP001104 | HBP001107 | HBP001108 |
| T4 RNA Ligase 2（10 U/µL） | 100 µL | 500 µL | 50 mL | 100 mL |
| 10× Reaction Buffer | 300 µL | 1500 µL | 150 mL | 300 mL |
| RNase-Free ddH2O | 1 mL | 5 mL | 500 mL | 1 L |
单位定义
一个单位的定义是在 37℃下，在 20 µL 的体系中，30 分钟内连接 0.4 µg 23-mer 和 17-mer RNAs 的等摩尔混合物所需的酶量。
质量控制
无 RNase、DNase 污染。
经考马斯亮蓝染色的 SDS-聚丙烯酰胺凝胶染色判断，T4 RNA 连接酶 2 纯度>90%。
使用说明
1）双链 RNA 或 DNA/RNA 杂合双链的底物制备：将 RNA 混合物或 DNA 和 RNA 的混合物（按摩尔质量比 1：1 混合），推荐的终浓度为 20 µM（10～50 µM 均可），65℃孵育 3 min，然后冰上孵育 2 min。
2）双链结构中 RNA 3′羟基和 DNA 5′磷酸基连接的反应体系（于冰盒上配制）：
| 组分 | 添加量 | 终浓度 |
| RNase-Free ddH2O | Up to 20 µL | — |
| Nicked DNA/RNA Substrate | X µL | 1 µM |
| 10× Reaction Buffer | 2 µL | 1× |
| 50% PEG 8000 | 4 µL | 10% |
| MgCl2（100 mM） | 1.6 µL | 8 mM |
| T4 RNA Ligase 2（10 U/µL） | 1 µL | 0.5 U/µL |
| Total | 20 µL | — |
3）对于双链 RNA 缺刻的连接，使用 T4 RNA Ligase 2 连接的反应体系（于冰盒上配制）：
| 组分 | 添加量 | 终浓度 |
| RNase-Free ddH2O | Up to 20 µL | — |
| Nicked DNA/RNA Substrate | X µL | 0.5 µM |
| 10× Reaction Buffer | 2 µL | 1× |
| T4 RNA Ligase 2（10 U/µL） | 1 µL | 0.5 U/µL |
| Total | 20 µL | — |
反应条件
连接反应：37℃孵育 30 min。如果发现效果欠佳可以尝试 25℃孵育 2 h。为了使连接反应更加充分，可以适当延长连接反应时间。
终止反应*：反应结束后加入蛋白酶 K 或 EDTA，即可终止反应。
*由于 T4 RNA Ligase 2 热失活需要 85℃加热 5 min，这样可能导致 dsRNA 或 DNA/RNA 杂合双链变性，因此通常不建议通过加热方式失活 T4 RNA Ligase 2。如果后续无需保持双链状态，则推荐 85℃加热 5 min 以失活 T4 RNA Ligase 2。
注意事项
1. 由于涉及 RNA 操作，需要严格按照 RNA 操作的规范进行，避免 RNase 污染，相关试剂和耗材需要经过 DEPC 处理去除 RNase 或者确保是 RNase free 的。本反应体系中涉及双链 RNA，双链 RNA 可以耐受 RNase A 和 RNase T1 等。如果涉及单链 RNA，包括 dsRNA 制备后存在部分 RNA 序列是单链的情况，可以考虑适量添加 RNase Inhibitor；
2. 如果同时进行多个连接反应，可以把上表中除 Nicked dsRNA Substrate 之外的所有溶液和酶提前预混合，然后再分装到各反应管内。可根据具体应用选择合适的操作方法，可能需准备额外的试剂，如 RNase inhibitor、DEPC 水等；
3. 反应体系中的 Nicked dsRNA Substrate 的最终浓度可以达到 1 µM，在该反应体系中可以确保充分连接。实际使用过程中，例如由于底物量有限等原因，可以适当减少 Nicked dsRNA Substrate 的用量，例如使最终浓度为 0.5 µM 或 0.2 µM 等；
4. 本产品仅限于专业人员科学研究用，为了您的安全健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
