热敏快速碱性磷酸酶（Thermosensitive Fast Alkaline Phosphatase，tsFast-AP）基因来源于 Antarctic Bacterium TAB5，在大肠杆菌中异源表达，该酶可催化 DNA、RNA 以及核苷酸 5'端和 3'端磷酸基团的水解，也能够去除蛋白磷酸基团，但不能催化磷酸二脂及磷酸三脂的水解。在 37℃ 的条件下作用 10 分钟，该酶即可使所有类型 DNA 的末端去磷酸化。
热敏快速碱性磷酸酶在 CutFlex 酶切 Buffer 中具有 100% 活性，因此与使用 CutFlex buffer 的内切酶进行“酶切-去磷酸化”反应时，可在同管内完成，大大简化了实验流程。且该酶 80℃ 温育 20 分钟就会完全不可逆失活，所以在开始连接反应或末端标记实验之前无需对该酶进行去除操作。
产品信息
| 产品名称 | 货号 | 规格 |
| 热敏快速碱性磷酸酶 | HSM060241 | 1000 U |
产品组分
| 组分 | 规格 |
| HSM060241A Thermosensitive Fast Alkaline Phosphatase (1 U/μL) | 1 mL |
| HSM060241B 10×tsFast-AP Buffer | 2×1 mL |
产品储存
-25~-15℃储存与运输，有效期 2 年。
活性定义
37℃ 条件下，1×tsFast-AP Buffer 环境中，10 min 内能够将 1 μg 线性化 pUC57 DNA 的 5' 末端去磷酸化所需要的酶量定义为 1 个活性单位（U）。
失活条件
80℃，20 min。
质量控制
核酸内切酶残留检测：将酶液与超螺旋质粒 DNA 在 37℃ 温育 4 h，通过 DNA 电泳检测质粒无变化。
核酸外切酶残留检测：将酶液与双链 DNA 底物在 37℃ 温育 16 h，通过 DNA 电泳检测双链 DNA 底物无变化。
宿主检测：将酶液中残留的核酸经 E.coli 16S rDNA 特异性的 TaqMan qPCR 检测，E.coli 基因组残留低于 10 拷贝。
使用方法
1. 质粒载体线性化与去磷酸化同步反应流程：
(1) 于冰上配制如下反应体系：
| 组分 | 使用量 |
| 质粒 DNAa | 1 μg |
| 10×CutFlex Buffer | 2 μL |
| Thermosensitive Fast Alkaline Phosphatase (1 U/μL) | 1 μL（1 U） |
| 限制性内切酶b | 1 μL |
| ddH2O | Up to 20 μL |
a：为了保证去磷酸化的效率，质粒 DNA 应不含 RNA 和基因组 DNA 污染。
b：限制性内切酶仅适用于 CutFlex Buffer 反应体系。
(2) 充分混匀并瞬离，37℃ 温育 15~30 min。
注：如果延长温育时间，可能产生星号活性。
(3) 80℃ 温育 20 min，以终止反应。
2. 核苷酸去磷酸化的实验流程
该方案适用于去除 DNA 的 3' 和 5' 端磷酸基团。
(1) 于冰上配制如下反应体系：
| 组分 | 使用量 |
| 线性 DNAa | 1 μg |
| 10×tsFast-AP Buffer | 2 μL |
| Thermosensitive Fast Alkaline Phosphatase (1 U/μL) | 1 μL（1 U） |
| ddH2O | Up to 20 μL |
(2) 充分混匀并瞬离，37℃ 温育 10 min。
(3) 80℃ 温育 20 min，以终止反应。
3. 蛋白质去磷酸基团的实验流程
(1) 于冰上配制如下反应体系：
| 组分 | 使用量 |
| 10×tsFast-AP Buffer | 2 μL |
| 磷酸化蛋白质 | 2~4 μg（终浓度 0.1~0.2 mg/mL） |
| Thermosensitive Fast Alkaline Phosphatase (1 U/μL) | 10 μL（10 U） |
| ddH2O | Up to 20 μL |
(2) 充分混匀并瞬离，37℃ 温育 1 h。
(3) 添加 EDTA 至 50 mM 的终浓度，或者添加钒酸钠（Na3VO4）至 10 mM 的终浓度，以终止反应。
注：以上为蛋白质去磷酸基团的反应体系和实验流程的举例，实验时请根据具体底物类型调整热敏快速碱性磷酸酶的使用量以及最佳温育时间。
注意事项
与热敏快速碱性磷酸酶结合的 DNA 在琼脂糖凝胶中可能会出现条带偏移或弥散，为避免此现象，可在样品中加入混有 SDS 的 Loading Buffer，先在 80℃ 温育 20 min，冰浴降温后再进行电泳。
